可鉴别非洲猪瘟病毒基因I型、II型以及自然重组毒株的引物探针组合及其应用

本发明涉及一种可鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的引物探针组合及其应用，属于病毒检测。

背景技术：

1、非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种高度致命的病毒性疾病，该病具有高传染性、快速传播和100％病死率等特点，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。非洲猪瘟于2018年首次传入我国，之后在国内迅速流行并持续蔓延。目前，非洲猪瘟疫病报道数量大幅度下降，但是该病已在我国定殖并造成了大面积的污染，疫病风险等级依旧很高。最早传入我国的非洲猪瘟病毒china/ln/2018/1、pig/hlj/18株、sy18株等均属于基因ii毒株，均有较高的致病性。2021年，国内再次报道了非洲猪瘟基因i型毒株的出现，hen/zz-p1/21株、sd/dy-i/21株等i型毒株均证实无红细胞吸附活性(had)，这也是国内基因i型毒株最具有代表性的生物学特性之一。2023年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室首次报道了从河南、江苏、内蒙古三地送检的疑似非洲猪瘟阳性样品中分离获得共计三株遗传上高度同源的非洲猪瘟基因i型和ii型自然重组毒株。这类重组毒株的b646l基因来自于基因i型，ep402r和mgf360-9l基因均来自于基因ii型。动物试验结果表明，该重组病毒对家猪具有高度致死性和传播力。

2、在当前基因ii型毒株、基因i型毒株以及基因i型和ii型自然重组毒株共同流行的复杂背景下，非洲猪瘟疫情的防控变得愈发的艰难。截至目前，临床上尚未开发出能够有效鉴别国内非洲猪瘟病毒自然重组毒株的qpcr检测方法。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一目的是提供了一种特异性高的用于鉴别非洲猪瘟病毒基因i型、ii型及其自然重组毒株的引物探针组合。本发明的第二目的是提供了一种含有上述引物探针组合的三重荧光pcr检测试剂盒及检测方法。

2、技术方案：本发明的可鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的引物探针组合，所述引物探针组合包括针对非洲猪瘟病毒自然重组毒株b602l基因设计的第一特异性引物对和探针、针对非洲猪瘟病毒基因i型毒株cd2v基因设计的第二特异性引物对和探针、针对非洲猪瘟病毒基因ii型毒株mgf360-9l基因设计的第三特异性引物对和探针。

3、其中，所述第一特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；第二特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，第二探针的核苷酸序列如seq id no.6所示；第三特异性引物对的核苷酸序列如seq idno.7～8所示，第三探针的核苷酸序列如seq id no.9所示。

4、其中，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记猝灭基团。

5、其中，所述荧光基团包括fam、hex和cy5；猝灭基团包括bhq1和bhq3。

6、本发明的鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物探针组合。

7、其中，所述试剂盒还包括dna聚合酶、ddh2o、阴性质控品和阳性质控品。

8、具体的，阴性质控品为无核酶水；阳性质控品为含有如seq id no.28所示的核苷酸序列的重组质粒。

9、本发明的鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的方法，包括以下步骤：提取待测样本的dna；以dna为模版，加入核苷酸序列如seq id no.1～2所示的第一引物对、核苷酸序列如seq id no.3所示的第一探针、核苷酸序列如seq idno.4～5所示的第二引物对、核苷酸序列如seq id no.6所示的第二探针、核苷酸序列如seqid no.7～8所示的第三引物对、核苷酸序列如seq id no.9所示的第三探针、dna聚合酶、ddh2o，进行pcr扩增，检测荧光信号。

10、其中，所述引物对和探针的浓度均为10μm；所述dna聚合酶浓度为0.5u/μl。

11、其中，所述pcr扩增的程序为95℃5min预变性；95℃变性15s，60℃30s，40个循环。

12、其中，所述鉴别检测的判定方法为：当仅检测到所述第一探针和所述第三探针发出的荧光时，所述待测样本中含有非洲猪瘟病毒自然重组毒株；当仅检测到所述第二探针发出的荧光时，所述待测样本中含有非洲猪瘟病毒基因i型毒株；当检测到所述第三探针发出的荧光时，所述待测样本中含有非洲猪瘟病毒基因ii型毒株。

13、其中，所述待测样本为动物组织、血清或全血中提取的dna核酸样本。

14、本发明通过大量的全基因序列比对分析发现：国内非洲猪瘟病毒自然重组毒株的b602l基因普遍存在特征性的核苷酸插入(如图1所示)。如果能针对此插入片段区域，建立起鉴别非洲猪瘟病毒自然重组毒株的qpcr检测方法，则会有效地提高临床中针对此类重组毒株的检出效率。此外，本发明还配备了针对非洲猪瘟病毒的cd2v基因和mgf360-9l基因保守区域设计的通用型检测引物对和探针，以实现对样品中非洲猪瘟病毒i型和ii型毒株的定性检测。因此，本发明公布了一种能够同时定性检测非洲猪瘟病毒i型、ii型及其自然重组毒株的三重荧光pcr检测方法，具有潜在的市场价值和重要的应用前景。

15、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明的引物探针组合，针对非洲猪瘟病毒自然重组毒株的b602l基因、非洲猪瘟病毒基因i型毒株的cd2v基因、非洲猪瘟病毒基因ii型毒株的mgf360-9l基因设计，可同时实现对非洲猪瘟病毒基因i型、基因ii型以及自然重组毒株的精准鉴别，具备检测耗时短、特异性强、灵敏度高等优势。

技术特征：

1.一种可鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括针对非洲猪瘟病毒自然重组毒株b602l基因设计的第一特异性引物对和探针、针对非洲猪瘟病毒基因i型毒株cd2v基因设计的第二特异性引物对和探针、针对非洲猪瘟病毒基因ii型毒株mgf360-9l基因设计的第三特异性引物对和探针。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示，第一探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；第二特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，第二探针的核苷酸序列如seq idno.6所示；第三特异性引物对的核苷酸序列如seq id no.7～8所示，第三探针的核苷酸序列如seq idno.9所示。

3.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记猝灭基团。

4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括fam、hex和cy5；猝灭基团包括bhq1和bhq3。

5.一种鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dna聚合酶、ddh2o、阴性质控品和阳性质控品。

7.一种鉴别非洲猪瘟病毒基因i型毒株、基因ii型毒株以及自然重组毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的dna；以dna为模版，加入核苷酸序列如seq id no.1～2所示的第一引物对、核苷酸序列如seq id no.3所示的第一探针、核苷酸序列如seq idno.4～5所示的第二引物对、核苷酸序列如seq id no.6所示的第二探针、核苷酸序列如seqid no.7～8所示的第三引物对、核苷酸序列如seq id no.9所示的第三探针、dna聚合酶、ddh2o，进行pcr扩增，检测荧光信号。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物对和探针的浓度均为10μm；所述dna聚合酶浓度为0.5u/μl。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的程序为95℃5min预变性；95℃变性15s，60℃30s，40个循环。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述鉴别检测的判定方法为：当仅检测到所述第一探针和所述第三探针发出的荧光时，所述待测样本中含有非洲猪瘟病毒自然重组毒株；当仅检测到所述第二探针发出的荧光时，所述待测样本中含有非洲猪瘟病毒基因i型毒株；当检测到所述第三探针发出的荧光时，所述待测样本中含有非洲猪瘟病毒基因ii型毒株。

技术总结本发明公开了一种可鉴别非洲猪瘟病毒基因I型毒株、基因II型毒株以及自然重组毒株的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合包括针对非洲猪瘟病毒自然重组毒株B602L基因设计的第一特异性引物对和探针、针对非洲猪瘟病毒基因I型毒株CD2v基因设计的第二特异性引物对和探针、针对非洲猪瘟病毒基因II型毒株MGF360‑9L基因设计的第三特异性引物对和探针。所述引物和探针核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示。本发明仅需一次qPCR扩增即可鉴别出待测样品是否为非洲猪瘟病毒基因I型或者基因II型毒株以及是否为非洲猪瘟病毒自然重组毒株。本发明具备检测效率高、时间短、成本低等优势，对于重大动物疫病的防控以及临床样品的快速、精准检测具有较大的意义。技术研发人员：李向东,余良政,王文强,朱振邦,文威受保护的技术使用者：扬州大学技术研发日：技术公布日：2024/8/16