人CD200受体的拮抗剂结合多肽分子及其应用的制作方法

本发明属于生物医学领域。具体涉及人cd200受体(cd200r)的拮抗剂结合多肽分子及其应用。

背景技术：

1、cd200(又称为ox2、ox-90、mox-2)是分子量为48kda的细胞表面糖蛋白，基因定位于染色体3q13.2，属于ⅰ型免疫球蛋白超家族成员。在中枢神经系统中则主要表达在神经元和血管内皮细胞上，在星状胶质细胞、少突胶质细胞和神经干细胞等细胞上也有所表达，是骨髓细胞功能下调的信号，可共刺激t细胞增殖。cd200与cd47、pd-1、ctla-4等免疫检查点分子具有结构相似性，其包含2个胞外免疫球蛋白样结构域：1个单跨膜的结构域和1个没有信号模体的短细胞质尾。

2、cd200r(在小鼠为cd200r1～5；在人类为cd200r1，r2)也属于ⅰ型免疫球蛋白超家族成员，是cd200的同源受体，具有2个细胞外免疫球蛋白样结构域和1个细胞质npxy模体。cd200r主要在髓细胞中表达，也在淋巴系细胞上检测到，如自然杀伤细胞(nk)和t细胞，并含有能够启动下游信号级联的细胞质尾部。

3、cd200在不同种属间表达相对保守，暗示着cd200/cd200r信号通路可能有重要的生理功能。d200r家族有cd200r1～5五个成员，仅cd200r1有较长的胞内片段，募集下游分子发挥生理功能；而cd200r家族除cd200r1外的其他受体则被认为可能通过跨膜区域的赖氨酸残基和其胞内的短序列在未知分子的桥接下发挥不同于cd200r1的功能。

4、cd200是一种免疫耐受信号分子，在维持机体自身免疫耐受中发挥重要作用。cd200-cd200r相互作用能抑制促炎分子如tnf-α、ifn-γ及诱导型一氧化氮合酶的表达，继而通过调节炎症免疫反应的激活阈值，保护免疫特权部位、干细胞和其他重要组织细胞免受免疫损伤，以及促进外周免疫耐受。此外，cd200-cd200r产生的免疫抑制效应在组织修复过程、移植物排斥反应、自身免疫性疾病及癌症监测中也起到关键性的作用。cd200与cd200r结合后可导致cd200r的npxy序列中的酪氨酸302磷酸化，激活dok2-rasgap复合物，抑制ras-erk信号传导，进而抑制髓系细胞活化。cd200与cd200r相互作用还能有效抑制t细胞免疫应答及nk细胞的杀伤活性，促进巨噬细胞分泌免疫抑制性色氨酸分解酶——吲哚胺-2，3-双加氧酶(ido)，并且诱导调节性t细胞扩增，导致th1细胞因子转变为th2细胞因子，从而抑制免疫应答反应。cd200/cd200r主要通过调节免疫和血管生成在肿瘤和非肿瘤疾病中发挥重要作用。由此可见，cd200/cd200r主要通过调节免疫和血管生成发挥重要作用。此外，cd200还能促进中枢神经系统神经发生，且与免疫调节作用无关。

5、cd200抑制剂samalizumab(alxn 6000，沙马组单抗)是一种针对cd200的新型重组人源化单克隆抗体，能特异性地结合cd200，阻断其与cd200r相互作用，研究的初步

6、结果支持了samalizumab可作为免疫检查点抑制剂在慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cll)治疗中发挥作用，但目前相关临床试验仍处于初级阶段，仍需要进一步的临床试验研究。中国专利cn114728048a公开了一种涉及结合人cd200受体(cd200r)的拮抗剂多肽分子、包含此类拮抗剂多肽分子的组合物以及使用此类拮抗剂多肽分子治疗癌症的方法。

7、与治疗性单克隆抗体相比，使用肽抑制剂作为免疫疗法具有更多优势。肽具有较低的毒性、较高的稳定性和较高的效率。由于其较小的尺寸，有着独特的特性，并且具有高的靶向精度，这意味着潜在副作用的风险较小。此外，肽可以很容易地合成、改变，并且与抗体相比，其生产成本更低，使其成为更有利的治疗方法，因此，仍然存在对人cd200r结合性拮抗剂多肽分子的需要。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种人cd200受体(cd200r)的拮抗剂结合多肽分子及其应用。

2、一方面，本发明提供了一种人cd200受体(cd200r)的拮抗剂结合多肽分子，其氨基酸序列如seq id no.1至seq id no.2所示，具体氨基酸序列如表1所示，其中，seq id no.1及seq id no.2的第1个氨基酸和第80个氨基酸通过肽键成环。

3、表1本发明氨基酸序列

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6、其中，氨基酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的多肽为从多肽库中，通过高通量筛选技术，检测细胞内钙离子浓度变化得到的80环肽，该环肽的发现包括多肽库溶解及稀释，利用elisa和tr-fret筛选方法根据多肽的抑制率结果从多肽库中筛选。

7、一方面，本发明本发明提供了一种人cd200受体(cd200r)的拮抗剂结合多肽分子，所述多肽分子是对seq id no.1和seq id no.2进行解压缩得到的。

8、优选地，本发明本发明提供了一种人cd200受体(cd200r)的拮抗剂结合多肽分子氨基酸序列如seq id no.3～11中所示。seq id no.3至seq id no.11为环状肽，具体地序列如表1所示。

9、一方面，本发明还提供一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含能够编码上述任一所述的人cd200r的拮抗剂多肽分子的一个或两个的多核苷酸。

10、优选地，所述多核苷酸分子包含能够编码能够编码seq id no.1至seq id no.11的多肽分子的一个或两个的多核苷酸。

11、另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。

12、通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

13、一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、静脉内、肝动脉、口服、皮下、皮内、或局部给药。

14、当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为静脉用或肝动脉药制剂或瘤内用药注射剂。

15、这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。

16、本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。

17、另一方面，本发明还提供一种上述多肽、多核苷酸或药物组合物在制备用于治疗与cd200/cd200r通路相关的疾病的药物上的应用。

18、进一步地，所述与cd200/cd200r通路相关的疾病包括实体肿瘤癌、血液系统恶性肿瘤、神经内分泌肿瘤癌。

19、优选地，该实体肿瘤癌可以选自神经母细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、睾丸癌或甲状腺癌。

20、优选地，该血液系统恶性肿瘤可以选自b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征或浆细胞瘤。

21、优选地，该神经内分泌肿瘤癌可以选自大细胞神经内分泌癌或胰腺神经内分泌癌

22、上述制备用于治疗与cd200/cd200r通路相关的疾病的药物可以与一种或多种免疫学药物同时、分开或顺序地组合施用。

23、术语

24、本文所用“多肽库”是湖南中晟全肽生化有限公司利用pict(peptideinformation compression technology)专利技术，该技术利用生物学手段对多肽信息进行压缩，可将多个多肽的信息集成进一个多肽，从而实现以相对较小的库容包含较大的多肽信息量；通过pict技术构建含有近73000条80个氨基酸的环肽库。其具体构建方法可以参见专利cn201580081102.3和专利cn201780089941.9。

25、本文所用“肽”或“多肽”的含义是被本专业领域的技术人员所熟知的。通常情况下，肽或多肽是两个或多个氨基酸由酰胺键链接，酰胺键则由一个氨基酸的氨基与相邻氨基酸的羧基构成。本文所述的多肽可包含天然存在的氨基酸或者非天然存在的氨基酸。可被修饰成其类似物、衍生物、功能模拟物、伪肽等诸如此类包含至少两个氨基酸的化合物。一个特定的氨基酸序列的多肽可以包括修饰的氨基酸和/或额外的氨基酸，除非n-和/或c-末端包含妨碍进一步添加氨基酸的修饰。这样的修改包括，例如，n-末端的乙酰化和/或c-末端的酰胺化。

26、本发明多肽可以是经过修饰的，修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式包括但不限于乙酰化、羧基化、烷基化、酰基化、氨基甲酰化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

27、本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术。另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸用来表达或生产重组的本发明多肽。由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。

28、本发明公开的多肽、包括它们的盐，也可以以它们的水合物形式或包含其溶剂(例如乙醇，dmso，等等)的形式存在，并可用于结晶。本发明公开化合物可以与药学上可接受的溶剂(包括水)固有地或通过设计形成溶剂化物；因此，本发明化合物包括溶剂化的和未溶剂化的形式。

29、本文所用的“人cd200r拮抗剂”指阻断人cd200配体与人cd200r的相互作用，拮抗cd200途径的免疫抑制效应(解除抑制)。cd200r的同义词有cd200r1、ox2r、mox2r和hcrtr2。

30、本文所用的术语“结合”指两个分子，例如cd200和cd200r之间的分子相互作用、本发明的多肽分子和cd200r之间的分子相互作用。

31、本文所用的“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在remington's pharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。

32、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

33、(1)本发明所用多肽库比传统化学合成多肽库信息量大得多的多肽化合物氨基酸序列，库内各化合物均为独立生产，均经过质谱鉴定和精确称量，保证了筛检的准确和稳定，避免了传统的噬菌体库等混合化合物库的失真(实际库容远低于理论值)问题。

34、(2)本发明提供了一系列人cd200r拮抗剂结合多肽分子，可以阻断人cd200配体与人cd200r的相互作用，拮抗cd200途径的免疫抑制效应(解除抑制)，可以用于制备治疗与cd200/cd200r通路相关的疾病的药物，所述疾病包括但不限于实体肿瘤癌、血液系统恶性肿瘤、神经内分泌肿瘤癌。