一组烟草SNP分子标记及应用的制作方法

本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一组烟草snp分子标记及应用。

背景技术：

1、烟草(学名：nicotiana tabacum)是茄属(nicotiana)的一种作物，全球范围内有种植，主要产地包括中国、巴西、印度和美国。烟草产业在中国经济中占有重要地位。因此，发展烟草育种不仅可以提升烟草产业的经济效益，还能增加农民收入，推动相关产业的发展。

2、选育优良新品种对烟草有重要意义：通过烟草育种，可以开发出适应不同地理和气候条件的新品种，提高产量和改善烟叶品质。这对于满足市场对高品质烟叶的需求非常关键。优质的烟叶可以提高烟草制品的竞争力，进一步增强经济效益；烟草作物易受多种病害的侵袭，如烟草花叶病毒(tmv)等。烟草育种能够开发出抗病或耐病品种，减少化学农药的使用，降低生产成本，同时有助于环境保护；随着健康意识的提高和相关政策的推行，烟草育种也需要考虑降低烟草制品中尼古丁、焦油等有害成分的含量，，以适应市场和政策的需求。此外，消费者对烟草品种的口感、风味有更高的要求，育种也需要围绕这些特性进行；烟草作为一种模型作物，在植物生物技术研究中具有重要地位。烟草的遗传背景简单，易于基因操作和转基因，因此在基因编辑、基因功能验证等研究领域具有重要应用价值。

3、综上所述，烟草育种在中国具有深远的经济、社会和科研意义，是连接农业、工业和科研的重要桥梁。但同时，鉴于烟草制品对公众健康的潜在影响，如何平衡经济效益和公共健康问题，是烟草育种和产业发展中需要考虑的重要方面。

4、定向改良(directed improvement)是育种学中的一种方法，旨在通过特定的选择和培育手段，有针对性地改良植物的某些特定性状。该方法通常结合遗传学、基因组学和分子生物学的先进技术，以提高植物的产量、品质、抗病虫害能力、适应性等。与传统育种相比，定向改良利用分子标记辅助选择(mas)和基因编辑等现代生物技术，直接针对特定的基因或基因位点进行改良，选择速度快且精确度高；可以显著缩短育种周期，有时在几代(几年)内就能完成目标性状的改良；通过精确定位目标基因，提高了选择的准确性和效率，减少了不必要的随机性；可以针对单一或多个特定性状进行精确改良，并且可以通过基因叠加技术实现多性状的同时改良。目前烟草育种过程中广泛使用了定向改良的方法。

5、烟草主栽品种定向改良过程中，主栽品种作为轮回亲本，需要用携带1-2个优良性状的供体亲本与轮回亲本多次回交，回交过程中，需要采用背景选择分子标记，选择轮回亲本背景恢复率高的单株。目前烟草定向改良背景选择中使用的基因芯片技术进行轮回亲本对的选择，常用的基因芯片如430k snp基因芯片(张剑锋等，2017)和55k snp芯片等，这些芯片都是基于axiom高密度基因分型策略的固相芯片，在定向育种过程中发挥了积极作用，比如张剑锋等(2017)利用烟草430k snp芯片在24个烟草品种间获得103133个高质量纯合多态性snp位点，其中有926个至8066个位点位于24条染色体上，分布较均匀。品种间聚类分析结果与品种间的系谱关系也基本一致。与烟草育种中使用的ssr等传统分子标记相比，430k snp芯片在多态性标记数量、检测效率和检测结果的可靠性方面都得到了显著提升；余世洲等(2023)也利用涵盖烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、雪茄烟、香料烟、药烟等150多种具有代表性的烟草品种材料的基因型重测序数据，基于公开发表的k326参考基因组，开发出18981个snp位点的高密度固相芯片。高密度固相芯片检测位点数量几万至几百万，适合确定的待测位点，高通量、规模化的基因分型，但位点一旦固定不能增减，检测的灵活性较低，且固相芯片依赖特定的耗材和仪器设备，检测成本也较高，这使得其应用受到限制。

6、在烟草主栽品种单个性状定向改良育种过程中，通常6个月一代，早花技术的发展，使烤烟3-4个月一代成为现实。通常在烟草苗期(3-4片真叶)取样进行前景选择，然后进行遗传背景选择，取样后1-2个月即可获得下一代种子。为达到高效的育种的目的，需要在一个月内获得背景选择的标记分型结果。获得结果时间越短，在降低移栽、杂交等工作量的效果越明显。然而，目前我国大多数烟草小规模育种项目组使用的高密度snp芯片，这种高密度芯片依赖特定的耗材和仪器设备，单个样品的检测成本较高、检测周期长，并且数据量巨大，育种技术人员数据处理困难，难以满足定向育种时效性高、成本低等要求。

7、与固相芯片相比，液相芯片在位点灵活性、检测成本等方面具有优势。液相芯片主要分为cgps(genotyping by pinpoint sequencing of liquid captured targets)液相芯片和mgps(genotyping by pinpoint sequencing of multiplex pcr products)液相芯片，其在动植物育种中已有应用(龙晓波等，2022)(zhou q等，2024)(lin w等，2023)。cgps是基于目标区间基因组序列液相捕获的精准定位测序分型技术，主要应用于高、中密度(3k-150k目标区间)靶向测序分型；mgps是基于多重pcr扩增的精准定位测序分型技术，主要应用于中、低密度(50-2000目标区间)靶向测序分型。其中多重pcr靶向测序分型技术(mgps)首先需要针对参考基因组的多个目标区间进行特异性引物设计，并通过多重pcr对多个不同目标序列在同一个pcr反应中特异性扩增，然后对pcr扩增子进行测序文库构建和二代高通量测序，从而获得目标位点的基因型，具有检测成本低、时效性高和数据分析利用简便的特点，更加适合烟草常规育种。

8、综上所述，开发出一种密度相对较低的烟草的snp分子标记位点，结合mgps液相芯片技术，研发出一种烟草液相育种芯片，对烟草育种具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对上述现有高密度烟草育种芯片位点过多、工作效率低、育种周期长、检测成本高，亟需开发一组密度较低的烟草育种液相芯片的问题，本发明结合20多份重要的烟草种质资源和云南烟草育种中应用的7个重要品种(云烟121、云烟87、云烟85、ry2925、k326、红花大金元、云烟97)，提供一组烟草snp分子标记及应用，本发明的具体技术方案如下：

2、本发明提供一组烟草snp分子标记，其特征在于，所述烟草snp分子标记包括以下1803个位点，所述1803个位点的物理位置是基于烟草k326参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/gca_000715075.2/)对比确定的，所述1803个snp位点如下表所示：

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12、本发明还提供一组烟草基因分型的试剂，所述试剂包括用于检测所述的一组烟草snp分子标记位点的探针组合。

13、本发明还提供一种烟草液相基因芯片，所述液相基因芯片包括所述的一组烟草snp分子标记。

14、优选地，还包括用于检测上述的一组烟草snp分子标记位点的探针组合。

15、本发明还提供一种用于扩增所述的一组烟草snp分子标记的引物。

16、本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测所述的一组烟草snp分子标记位点的引物组。

17、本发明还提供所述的一组烟草snp分子标记、所述一组烟草基因分型的试剂、所述的烟草液相基因芯片和所述的试剂盒中的至少一种在烟草基因型分型、遗传多样性评估、聚类分析、种质资源和亲缘关系鉴定、基因图谱构建及基因定位、重要性状基因的挖掘鉴定和功能解析、分子标记辅助选择、全基因组关联分析、全基因组选择中的至少一种应用。

18、本发明还提供一种烟草育种方法，包括如下步骤：利用如所述的一组烟草snp分子标记、所述的一组烟草基因分型的试剂、所述的烟草液相基因芯片和所述的试剂盒中的至少一种，对烟草dna进行检测，选择合适烟草材料进行后续育种。

19、本发明的有益效果如下：

20、传统的分子标记技术存在许多局限性，如通量低、操作过程繁琐等；现有的高密度烟草固相芯片操作繁杂，时效性低，成本高，不能满足烟草定向育种快速、高效的需求。为了能快速计算不同烟草品种间的背景恢复率，对育种材料的进行精确选择，提高定向育种的效率，本发明收集了20多份重要的烟草种质资源，并对这些材料进行了全基因组重测序；另外还收集了云南烟草育种中应用的重要品种云烟121、云烟87、云烟85、ry2925、k326、红花大金元、云烟97进行烟草430k固相芯片分型检测，有针对性地进行了品种间差异位点的筛选，基于高通量测序技术，最终筛选出能较为全面的表征核心烟草品种性状的、可组合、互不干扰地进行扩增反应的1803个位点。

21、本发明提供的烟草snp分子标记位点相对密度较低，可进一步制作成烟草液相基因芯片，该芯片可以通过多重pcr同时对1803个目标区间进行特异性扩增，然后对pcr扩增子进行测序文库构建和二代测序，从而获得目标区间内的所有位点的基因型，极大的提高了检测效率，降低了检测成本。该烟草液相基因芯片解决了现有高密度固相芯片位点过多、操作繁杂、数据分析困难、时效低、成本高的问题，实现了烟草快速、高效、低成本基因型分型，满足烟草定向育种高效、快速的要求。

22、本发明提供的烟草snp分子标记还可制作基因分型试剂、试剂盒等产品，可用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、亲本材料评估、基因/qtl定位、标记辅助背景选择等工作，将为烟草定向育种工作提供重要技术支撑。