一种酵母工程菌及其应用

本发明属于基因工程，具体地，涉及一种酵母工程菌及其应用。

背景技术：

1、重组蛋白是合成生物学技术最为重要的产品之一，在化工、医药和食品等领域发挥巨大作用。常见的重组蛋白生产系统主要有4类：细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞杆状病毒表达系统和动植物细胞表达系统。其中，毕赤酵母(komagataella phaffii)是典型的酵母表达系统，目前已经被广泛应用于多种抗体、疫苗、工业酶等重组蛋白的高效生产。为了降低成本，常常需要通过改造宿主提高重组蛋白的分泌表达量，对于宿主细胞改造研究主要针对潜在的关联基因进行表达水平调控。毕赤酵母全基因组规模为9,383,226个碱基对，含有5,364个蛋白编码基因，与基因层次相比，在碱基层次上的改造能够进一步在更大的序列空间内探索表型“高地”。

2、在真核生物的蛋白分泌过程中，分泌蛋白进入内质网(endoplasmic reticulum,er)进行共翻译和翻译后修饰(如糖基化、磷酸化和二硫键形成)。只有折叠正确的蛋白才会离开内质网并经胞吐途径继续分泌。内质网中未折叠和错误折叠蛋白的积累会激活未折叠蛋白响应机制(unfoleded protein response,upr)，进而激活下游的折叠酶、分子伴侣、内质网相关的蛋白降解途径。在酵母中，upr途径的激活受转录激活因子hac1(transcriptional activator hac1)调控，该转录因子能够调控upr途径中响应元件的表达。

3、分泌蛋白中二硫键的形成是通过内质网中氧化折叠机制实现的，该过程会导致活性氧(ros)累积，对细胞成分造成损伤。转录因子yap1(oxidative stress responsetranscription factor)在氧化应激反应的调节中起主要作用，是缓解ros累积所必需的。

技术实现思路

1、在酵母中，hac1基因和yap1基因的过表达已被报道可提高外源蛋白的分泌表达量。然而，目前为止，尚未有对hac1基因和yap1基因进行突变以提高毕赤酵母外源蛋白分泌表达量的相关报道。

2、本申请的目的在于提供一种酵母工程菌及其在提高外源蛋白分泌表达量中的应用。

3、具体来说，本申请涉及如下方面：

4、1.一种酵母工程菌，其中所述酵母工程菌通过对hac1基因编码的氨基酸进行突变获得，所述突变为第224位丝氨酸突变为亮氨酸，其中氨基酸位置是基于seq id no:2所示的氨基酸序列进行编号；或

5、所述酵母工程菌通过对yap1基因编码的氨基酸进行突变获得，所述突变为第44位丙氨酸突变为苏氨酸，其中氨基酸位置是基于seq id no:5所示的氨基酸序列进行编号。

6、2.根据项1所述的酵母工程菌，其中所述hac1基因编码的第200位-第250位氨基酸序列如seq id no:1所示。

7、3.根据项2所述的酵母工程菌，其中所述hac1基因编码的氨基酸序列如seq idno:2所示，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

8、4.根据项3所述的酵母工程菌，其中所述hac1基因核苷酸序列如seq id no:3所示，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

9、5.根据项1所述的酵母工程菌，其中所述yap1基因编码的第30位-第70位氨基酸序列如seq id no:4所示。

10、6.根据项5所述的酵母工程菌，其中所述yap1基因编码的氨基酸序列如seq idno:5所示，或与其具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

11、7.根据项6所述的酵母工程菌，其中所述yap1基因核苷酸序列如seq id no:6所示，或与其具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

12、8.根据项1-7中任一项所述的酵母工程菌，其中所述酵母为毕赤酵母。

13、9.根据项8所述的酵母工程菌，其中所述毕赤酵母为来源于毕赤酵母x33的毕赤酵母，优选为毕赤酵母x33、毕赤酵母gs115、毕赤酵母km71、毕赤酵母km71h、毕赤酵母smd1168、毕赤酵母smd1168h或毕赤酵母smd1163。

14、10.一种提高外源蛋白分泌表达量的方法，其中所述方法包括以下步骤：

15、利用项1-9中任一项所述的酵母工程菌提高外源蛋白分泌表达量。

16、11.根据项10所述的方法，其中所述外源蛋白由外源基因编码，所述外源基因通过基因组整合型载体整合在所述酵母工程菌中。

17、12.根据项11所述的方法，其中所述基因组整合型载体为ppic系列中的任意载体，优选地，所述基因组整合型载体为ppiczαa。

18、13.根据项11所述的方法，其中所述外源蛋白长度为200-720个氨基酸，等电点为5.3-6.0。

19、14.根据项13所述的方法，其中所述外源蛋白选自hsa、gbp1、3-2a2-4和植酸酶中的一种或两种以上。

20、15.根据项14所述的方法，其中所述外源蛋白为hsa、hsa-gbp1融合蛋白、hsa-3-2a2-4融合蛋白或植酸酶。

21、16.根据项10所述的方法，其中所述方法包括使用bmgy培养基接种培养所述酵母工程菌以获得高密度菌体，所述bmgy培养基以甘油作为碳源。

22、17.根据项10所述的方法，其中所述方法包括使用bmmy培养基接种培养所述酵母工程菌以发酵表达外源蛋白，所述bmmy培养基以甲醇作为碳源。

23、18.根据项1-9中任一项所述的酵母工程菌在提高外源蛋白分泌表达量中的应用。

24、本申请通过对hac1基因编码的第224位氨基酸进行突变，将丝氨酸突变为亮氨酸；或对yap1基因编码的第44位氨基酸进行突变，将丙氨酸突变为苏氨酸，构建了一株酵母工程菌，该酵母工程菌提高了外源蛋白的分泌表达量。因此，有利于进一步降低工业化生产重组蛋白的成本，从而扩大重组蛋白在医药、化工及食品等领域的应用范围。

技术特征：

1.一种酵母工程菌，其中所述酵母工程菌通过对hac1基因编码的氨基酸进行突变获得，所述突变为第224位丝氨酸突变为亮氨酸，其中氨基酸位置是基于seq id no:2所示的氨基酸序列进行编号；或

2.根据权利要求1所述的酵母工程菌，其中所述hac1基因编码的第200位-第250位氨基酸序列如seq id no:1所示。

3.根据权利要求2所述的酵母工程菌，其中所述hac1基因编码的氨基酸序列如seq idno:2所示，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

4.根据权利要求3所述的酵母工程菌，其中所述hac1基因核苷酸序列如seq id no:3所示，或与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

5.根据权利要求1所述的酵母工程菌，其中所述yap1基因编码的第30位-第70位氨基酸序列如seq id no:4所示。

6.根据权利要求5所述的酵母工程菌，其中所述yap1基因编码的氨基酸序列如seq idno:5所示，或与其具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

7.根据权利要求6所述的酵母工程菌，其中所述yap1基因核苷酸序列如seq id no:6所示，或与其具有至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的酵母工程菌，其中所述酵母为毕赤酵母。

9.根据权利要求8所述的酵母工程菌，其中所述毕赤酵母为来源于毕赤酵母x33的毕赤酵母，优选为毕赤酵母x33、毕赤酵母gs115、毕赤酵母km71、毕赤酵母km71h、毕赤酵母smd1168、毕赤酵母smd1168h或毕赤酵母smd1163。

10.一种提高外源蛋白分泌表达量的方法，其中所述方法包括以下步骤：

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述外源蛋白由外源基因编码，所述外源基因通过基因组整合型载体整合在所述酵母工程菌中。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因组整合型载体为ppic系列中的任意载体，优选地，所述基因组整合型载体为ppiczαa。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述外源蛋白长度为200-720个氨基酸，等电点为5.3-6.0。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述外源蛋白选自hsa、gbp1、3-2a2-4和植酸酶中的一种或两种以上。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述外源蛋白为hsa、hsa-gbp1融合蛋白、hsa-3-2a2-4融合蛋白或植酸酶。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法包括使用bmgy培养基接种培养所述酵母工程菌以获得高密度菌体，所述bmgy培养基以甘油作为碳源。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法包括使用bmmy培养基接种培养所述酵母工程菌以发酵表达外源蛋白，所述bmmy培养基以甲醇作为碳源。

18.根据权利要求1-9中任一项所述的酵母工程菌在提高外源蛋白分泌表达量中的应用。

技术总结本申请提供了一种酵母工程菌，所述酵母工程菌通过对Hac1基因编码的氨基酸进行突变获得，所述突变为第224位丝氨酸突变为亮氨酸；或通过对Yap1基因编码的氨基酸进行突变获得，所述突变为第44位丙氨酸突变为苏氨酸。本申请构建的酵母工程菌提高了外源蛋白的分泌表达量，有利于进一步降低工业化生产重组蛋白的成本，从而扩大重组蛋白在医药、化工及食品等领域的应用范围。技术研发人员：张翀,袁姚梦,廖锡豪,王怡,邢新会受保护的技术使用者：清华大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20