一种高热稳定性烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用

本发明涉及分子生物学与酶工程，特别涉及烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其在合成β-烟酰胺单核苷酸的应用。

背景技术：

1、烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，nmn)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)代谢途径中的重要中间代谢物。在机体内通过转化为nad+，nmn得以发挥其生理功能，如激活以nad+为唯一底物的ⅲ型蛋白赖氨酸脱乙酰酶(sirtuins)、维持细胞氧化还原状态、调节细胞凋亡。研究发现通过调节生物体内nmn的水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的预防、治疗和修复作用。

2、由于β-烟酰胺单核苷酸(nmn)在延缓衰老、修复脑损伤、等方面显示出良好的治疗和修复作用，及最新研究进展显示其或可以预防空气污染物的肺损伤，诸多功能使其受到的更多的关注，市场对其的需求与日俱增。

3、现有的nmn生产方法主要有化学合成法，微生物发酵法，体外酶催化法三种。化学合成法起始较早，已有多种合成nmn化学合成方法得到专利授权，但其存在手性拆分困难、有机溶剂残留容易产生有害残留物质等问题，逐渐被市场淘汰，利用生物合成法进行nmn的制备已成为行业内的发展趋势。微生物发酵法和体外酶催化法都可以归为生物合成法，但发酵法存在体内代谢通路调控难度大，生产效率低，不利于工业规模生产，体外酶催化合成法是目前最为理想的nmn生产方法。现有体外酶催化合成法大多数需要烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt，ec 2.4.2.12)的参与，该酶以5'-磷酸核糖焦磷酸(prpp)与烟酰胺(nam)为底物催化生成nmn。在酶的体外催化反应的应用中，热稳定性是提高一种酶蛋白可操作性的关键因素之一，目前现有nampt的热稳定性均较差，大大提高了酶的制备成本并严重影响nmn产量。基于以上背景，改造获得高热稳定性的nampt突变体并将其应用于催化合成nmn，并且通过固定化技术提高其重复使用性及可操作性，对于降低nmn生产成本，推动nmn体外酶催化合成法的工业化发展具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有烟酰胺磷酸核糖转移酶的稳定性较低、工业生产能力差的问题，本发明的目的在于提供一种高热稳定性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种高热稳定性烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列为参考序列，359位点发生单点突变。

4、本发明中的亲本是指来自sulfurovum sp.fs06-10的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2。所述突变体与seq id no.2所示的氨基酸序列相比包含第359位的ala突变为phe，其核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4。

5、所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体在催化反应合成nmn中的应用。所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体可应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中，所述工艺可以是生物酶催化工艺也可以是微生物发酵或全细胞催化工艺。也可将烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体制备成固定化酶，将固定化酶应用于烟酰胺单核苷酸的工艺中。

6、优选地，所述催化反应的温度为50±10℃。

7、优选地，所述催化反应温度为50±5℃。

8、上述制备nmn的生物酶催化工艺具体是指用生物酶催化底物nam和prpp转化成nmn的工艺，其中的生物酶是本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体或者是本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体和一种或者多种其他酶的联合使用，也可是由本发明突变体制备的固定化酶，其中的底物可以是prpp和烟酰胺，也可以是能够转化成prpp或者烟酰胺的前体物质，例如以烟酰胺、atp和核糖为原料，在本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体与核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下制备nmn。

9、优选地，所述突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞。

10、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，通过对烟酰胺磷酸核糖转移酶基因序列进行定点突变，最终获得具有高稳定性的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，该突变体可以高效催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸转变为nmn，并进一步的将其制备成固定化酶，使其可被重复使用，极大地降低nmn体外酶催化合成过程中的生产成本，具有较高的工业应用价值。

技术特征：

1.一种高热稳定性烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:4所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no:3所示。

3.权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体在催化反应合成nmn中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述催化反应的温度为50±10℃。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述催化反应温度为50±5℃。

6.根据权利要求3或4或5所述的应用，其特征在于，所述催化反应的底物为prpp和nam，或者是能够转化成prpp或者烟酰胺的前体物质。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述突变体联合核糖磷酸焦磷酸激酶、核糖激酶，催化反应生成nmn。

8.根据权利要求3～7任一项所述的应用，其特征在于，所述突变体的使用形式为酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶或者固定化含酶细胞。

技术总结本发明提供了一种高热稳定性烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用，所述突变体通过基因定点突变的方法获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明突变体的半衰期相比于亲本蛋白提高8.5倍。在相同反应条件下，突变体催化生产NMN的能力高于亲本蛋白，能够延长生产时间。并将突变体蛋白进行固定化，将固定化酶应用在制备烟酰胺单核苷酸的工艺中，提高了酶的重复利用性，和可操作性，降低了酶制备成本，具有较高的市场竞争力与工业应用价值。技术研发人员：林影,梁书利,杜晨烽,夏黎明受保护的技术使用者：华南理工大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20