一种荧光载体及其构建方法与应用

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种荧光载体及其构建方法与应用。

背景技术：

1、acta2是编码肌动蛋白的基因，主要在平滑肌细胞中表达，该基因的突变可能会导致多种疾病的发生，如主动脉夹层、家族性胃肠平滑肌瘤病、动脉粥样硬化和心机梗死等。常用于检测acta2转录的技术为qrt-pcr和蛋白印迹(western blot，wb)，但是qrt-pcr和wb对细胞的数量有较高的要求，通常要求待检测细胞的细胞量需要达到107个，而通常分离提取出的原代细胞扩增到这个量所需时间较长，同时，qrt-pcr和wb的检测步骤繁琐、结果容易造成假阳性、假阴性，实验过程中涉及的有毒有害试剂较多，不适合用于高通量筛选出来表达acta2基因的细胞。因此，亟需一种所需细胞数量少、可以快速、高效检测细胞是否表达acta2的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种荧光载体及其构建方法与应用，所述荧光载体能够快速筛选得到表达acta2基因的细胞，具有灵敏度高、特异性强、适合用于高通量筛选表达acta2细胞的优点。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种荧光载体，所述载体为含有荧光蛋白编码序列和acta2启动子序列的慢病毒载体。

4、本发明通过在慢病毒载体中插入荧光蛋白编码序列和acta2启动子序列制备得到荧光载体，当荧光载体转入至细胞内acta2启动子能够被参与acta2转录的rna聚合酶识别，使荧光载体中的荧光蛋白编码序列表达，从而使细胞发出荧光。

5、作为本发明所述荧光载体的优选实施方式，所述荧光蛋白编码序列为绿色荧光蛋白和/或红色荧光蛋白。

6、作为本发明所述荧光载体的优选实施方式，所述绿色荧光蛋白序列如seq idno.1所示，所述红色荧光蛋白序列如seq id no.2所示。

7、作为本发明所述荧光载体的优选实施方式，所述acta2启动子序列如seq id no.3所示。

8、作为本发明所述荧光载体的优选实施方式，所述慢病毒载体为pcdh-cmv-mcs-ef1-mcherry-t2a-puro载体。

9、第二方面，本发明提供了上述荧光载体的构建方法，其包括以下步骤：

10、s1、通过重叠pcr技术得到homo-acta2 promoter片段，通过pcr技术得到egfp片段，将homo-acta2 promoter片段与egfp片段连接，得到homo-acta2-promoter-egfp片段；

11、s2、将步骤s1所得homo-acta2-promoter-egfp片段通过酶切酶连替换至慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-mcherry-t2a-puro的cmv启动子区域中，得到慢病毒载体pcdh-homo-acta2-promoter-egfp-ef1-mcherry-t2a-puro，所得慢病毒载体pcdh-homo-acta2-promoter-egfp-ef1-mcherry-t2a-puro即为荧光载体。

12、第三方面，本发明提供了上述荧光载体在检测细胞和/或组织中的acta2表达中的应用。

13、第四方面，本发明提供了一种检测细胞中的acta2表达的方法，将上述荧光载体转染至目的细胞中观察目的细胞中的荧光情况；

14、当目的细胞发出红色荧光和绿色荧光时，则表示目的细胞表达acta2；当目的细胞发出红色荧光、不发出绿色荧光时，则表示目的细胞不表达acta2。

15、本发明通过在慢病毒载体中插入绿色和红色荧光蛋白编码序列和acta2启动子序列，将载体转染至细胞中通过荧光显微镜等可观察荧光的仪器即可判断细胞是否转录acta2。

16、作为本发明所述方法的优选实施方式，所述观察目的细胞中的荧光情况的手段采用以下至少一种的仪器完成：荧光显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计和荧光分析仪。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

18、(1)本发明通过在慢病毒载体中插入荧光蛋白编码序列和acta2启动子序列制备得到荧光载体，当荧光载体转入至细胞内acta2启动子能够被参与acta2转录的rna聚合酶识别，使荧光载体中的荧光蛋白编码序列表达，从而使细胞发出荧光。

19、(2)本发明通过在慢病毒载体中插入绿色和红色荧光蛋白编码序列和acta2启动子序列，将载体转染至细胞中通过荧光显微镜等可观察荧光的仪器即可判断细胞是否转录acta2，无需对细胞进行其他处理，简单快捷、不受仪器的限制、安全性高、准确度高；同时，本发明的检测方法灵敏度高，96孔细胞板单孔细胞也可通过此方法检测是否表达acta2；特异性好，仅针对acta2转录，不受其他基因表达的影响。

技术特征：

1.一种荧光载体，其特征在于，所述载体为含有荧光蛋白编码序列和acta2启动子序列的慢病毒载体。

2.如权利要求1所述荧光载体，其特征在于，所述荧光蛋白编码序列为绿色荧光蛋白和/或红色荧光蛋白。

3.如权利要求2所述荧光载体，其特征在于，所述绿色荧光蛋白序列如seq id no.1所示，所述红色荧光蛋白序列如seq id no.2所示。

4.如权利要求1所述荧光载体，其特征在于，所述acta2启动子序列如seq id no.3所示。

5.如权利要求1所述荧光载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pcdh-cmv-mcs-ef1-mcherry-t2a-puro载体。

6.如权利要求1所述荧光载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求1-5任一项所述荧光载体在检测细胞和/或组织中的acta2表达中的应用。

8.一种检测细胞中的acta2表达的方法，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述荧光载体转染至目的细胞中观察目的细胞中的荧光情况；

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述观察目的细胞中的荧光情况的手段采用以下至少一种的仪器完成：荧光显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计和荧光分析仪。

技术总结本发明涉及一种荧光载体及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明所述荧光载体为含有荧光蛋白编码序列和ACTA2启动子序列的慢病毒载体。本发明通过在慢病毒载体中插入荧光蛋白编码序列和ACTA2启动子序列制备得到荧光载体，当荧光载体转入至细胞内ACTA2启动子能够被参与ACTA2转录的RNA聚合酶识别，使荧光载体中的荧光蛋白编码序列表达，从而使细胞发出荧光以判断该细胞是否转录ACTA2。技术研发人员：曾文锋,江咏雪,黄鹏翰,陈嘉宁受保护的技术使用者：中山大学孙逸仙纪念医院技术研发日：技术公布日：2024/8/20