HRE报告基因786-O稳转细胞株的构建和应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种hre报告基因786-o稳转细胞株的构建和应用。

背景技术：

1、在低氧环境中，机体能够自发的发生低氧反应以维持机体的氧获得能力。1992年，semenza等发现一种蛋白能够特异性结合于促红细胞生成素基因的低氧反应元件(hre)，并影响某些基因的表达，该蛋白被称为低氧诱导因子(hif)。hif的靶基因十分广泛，能够影响机体造血功能、血管生成、铁离子转运、葡糖利用、抵抗氧化应激、细胞分化、细胞生存和凋亡、细胞外基质稳态以及肿瘤发生。hif是α、β亚基组成的异质二聚体，α亚基属于功能性亚基，对细胞内氧浓度的变化非常敏感并受高度调控，有调节hif活性的作用；β亚基是结构亚基，在细胞内稳定表达，其mrna转录和蛋白的表达水平不受氧浓度变化的影响。hif的α、β亚基都属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子超家族成员。人类的hifα有hif-1α、hif-2α、hif-3α三种亚型。hif-1α在体内呈普遍性分布，并在局部组织缺血或缺氧引发的血管生成过程中有重要作用，但是对铁代谢过程的影响较小；hif-2α呈局限性分布，对肾组织epo(促红细胞生成素)基因表达和合成的过程中有重要作用，此外，还通过上调十二指肠的细胞色素和二价金属转运体-1的表达提高铁在肠道的吸收，并且有降低肝杀菌肽表达的作用，在铁代谢过程中起主导作用；hif-3α的结构与其他亚型不同，没有dna结合区域，不能影响基因的表达。研究表明，hif-3α可能在hif介导的基因表达中有负调节的作用。因此，hif-1α、hif-2α在低氧反应过程中发挥一定的作用。一项hif-1α、hif-2α基因缺失的小鼠试验中，证实hif-1α、hif-2α在低氧反应过程中的必要性。而治疗慢性肾性贫血的化合物研发中，hif-2α的变化较hif-1α更重要，是调节红细胞生成素(epo)表达的主要转录因子。

2、常规生物学检测hif2α激动剂实验手段为：检测hif2α转录活性变化情况，利用肝癌细胞(hepg2、hep3b等)、肾癌细胞(786-o)等，给药后，qpcr检测hif2α下游基因(epo、vegf、cyclin d1等)的表达量。该实验耗时长、操作步骤复杂、结果干扰因素多，且趋势不明显不利于结果分析。

3、检测报告基因(例如：荧光素酶基因，luciferase)翻译出来的酶活性，常用于表征细胞内转录活性。在有atp、氧气、底物(luciferin)的环境中，荧光素酶可催化反应，释放出可被酶标仪检测到的光，光的强弱可代表荧光素酶量的多少。该方法灵敏度高、干扰背景低，是一个极优的转录活性检测方法。

4、786-o细胞是人肾透明细胞腺癌细胞，由于vhl的表达缺失而导致细胞内hif2α大量累积，进而诱导多种hif2α下游靶基因的表达，因此是研究hif2α激动剂的优秀细胞系。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种hre报告基因慢病毒载体，以及含该载体的细胞株hre报告基因786-o稳转细胞株。hre报告基因786-o稳转细胞株可应用于hif2α激动剂药物研发过程中生物活性测定，提供的生物活性测定方法，解决了检测繁琐时间久，实验成本高，检测方法不灵敏、易被干扰等难题。

2、本发明提供了hre报告基因慢病毒载体，其为含有3xhre序列的慢病毒表达载体；3xhre序列如seq id no.1所示。

3、seq id no.1：

4、cgagctctgtcacgtcctgcacgactctagttgtcacgtcctgcacgactctagttgtcacgtcctgcacgacgctagc

5、在一些实施例中，所述hre报告基因慢病毒载体是通过将慢病毒载体质粒plv[exp]-puro-luciferase进行酶切线性化，再与3xhre连接获得连接物，再将所述连接物转化至dh5α感受态细胞，抽提阳性质粒即为hre报告基因慢病毒载体plv[exp]-puro-3xhre-luciferase。

6、另一方面，本发明提供了一种hre报告基因786-o稳转细胞株，包含本发明所述的hre报告基因慢病毒载体plv[exp]-puro-3xhre-luciferase。

7、另一方面，本发明还提供了一种hre报告基因786-o稳转细胞株的构建方法，包括：构建hre报告基因过表达慢病毒；转染目的细胞株；通过真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的hre报告基因稳转细胞株。

8、在一些实施例中，所述构建方法包括步骤：

9、(1)构建hre报告基因过表达慢病毒：利用转染剂将本发明所述的hre报告基因慢病毒载体plv[exp]-puro-3xhre-luciferase与慢病毒包装质粒和辅助质粒共转让293ft细胞；收集hre报告基因过表达慢病毒；

10、(2)转染目的细胞株：利用助转染剂将hre报告基因过表达慢病毒转染786-o细胞株；

11、(3)通过真核抗生素筛选和单克隆挑选：采用含有真核抗生素的培养基和细胞生长培养基交替培养传代，挑选单克隆传代获得hre报告基因稳转细胞株。

12、在一些实施例中，步骤(1)中，所述转染剂为pei；所述慢病毒包装质粒为pspax2；所述辅助质粒为pmd2.g；本发明所述的hre报告基因慢病毒载体plv[exp]-puro-3xhre-luciferase与慢病毒包装质粒和辅助质粒的比例为(2-6)：(2-6)：1；优选地为5：5：1。

13、在一些实施例中，步骤(2)中，所述助转染剂为polybrene；所述hre报告基因过表达慢病毒的量根据moi确定。

14、在一些实施例中，所述助转染剂polybrene的浓度为2-6μg/ml；moi为10-50；优选地，所述助转染剂polybrene的浓度为5μg/ml；moi为30。

15、在一些实施例中，步骤(3)中，所述含有真核抗生素的培养基为含puromycin的rpmi-1640培养基；优选地，所述puromycin的浓度为1-10μg/ml；优选为4.0μg/ml。

16、在一些实施例中，步骤(3)中，所述的puromycin对细胞进行筛选浓度为4.0μg/ml，并维持该浓度培养传代3次后，进行单克隆挑选；将细胞以1个/孔，200μl/孔种至96孔板中，培养7-14天，显微镜下观察细胞状态，挑选单克隆传代至24孔板中，待细胞长满后，胰酶消化传至6孔板，再经6cm、10cm皿放大培养得到单克隆。

17、另一方面，本发明还提供了一种利用本发明所述的hre报告基因786-o稳转细胞株或本发明所述构建方法构建的hre报告基因786-o稳转细胞株测定hif2α激动剂药物的活性的方法。

18、有益效果

19、与现有技术相比，本技术的优点及积极效果至少如下：

20、(1)本技术提供的hre报告基因786-o稳转细胞株的构建方法步骤简便。

21、(2)本技术提供的hre报告基因786-o稳转细胞株应用于hif2α激动剂药物生物活性检测方法，该方法灵敏度高、干扰背景低。

22、术语说明

23、现在详细描述本发明的某些实施方案。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本技术不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本技术为准。

24、应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

25、除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

26、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

27、在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有n值的数字时，任何具有n+/-1％、n+/-2％、n+/-3％、n+/-5％、n+/-7％、n+/-8％、n+/-10％、n+/-15％或n+/-20％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。