一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法

本发明涉及原生鞭毛虫传代培养，尤其涉及一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法。

背景技术：

1、淀粉卵涡鞭虫(amyloodinium ocellatum)是一种原生鞭毛虫，主要寄生于热带、亚热带海水鱼类的鳃、皮肤和鳍条等部位，对养殖鱼类具有严重危害性。淀粉卵涡鞭虫对宿主没有选择特异性，几乎可以感染所有海水鱼类。当有少量虫体寄生时，病鱼不会表现出病理特征，往往难以察觉。当严重感染时，病鱼体色变暗，体表黏液分泌增多，摄食量减少，呼吸频率加快，鱼体呼吸困难，最终缺氧死亡。该虫已成为感染海水鱼类的主要寄生虫之一，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。

2、淀粉卵涡鞭虫生活史简单，可分为营养体、胞囊和涡孢子3个阶段。营养体为虫体唯一的寄生生活阶段，通过假根附着于宿主的上皮细胞并获取营养，待发育成熟后营养体缩回假根并从宿主脱落，沉到水底发育形成胞囊。胞囊为分裂增殖阶段，以均等二分裂的方式增殖并孵化出涡孢子。涡孢子为自由感染阶段，具有侵染能力，虫体可通过鞭毛在水中自由游动寻找新的宿主进行寄生，完成一个生活史周期。

3、淀粉卵涡鞭虫的生命循环离不开活鱼，因此在实验条件下为获得足够的淀粉卵涡鞭虫用于实验，可采用在体培养的方法。yoshinaga和dickerson(1994)使用黑鳉为宿主对刺激隐核虫进行在体培养，将患病鱼与未患病鱼进行同居培养，但此方法不稳定，不能定量控制感染水平，感染过度或过低均易导致培养失败；houghton和matthews(1986)以鲤鱼为宿主进行在体培养小瓜虫9个月，最终因虫体老化失去感染力而导致传代失败。因此，探索在体培养方式以及确定培养条件，获得一套培养条件可控的在体培养体系是必要的。

4、淀粉卵甲藻病主要流行在春夏季节，但是在其他季节，淀粉卵涡鞭虫可能在温度较低的时候作为胞囊休眠起来，等到温度适宜其发育时再一次爆发。这为探寻淀粉卵涡鞭虫低温保存策略提供了可行性，通过在实验室条件下将胞囊低温保存，一定时间范围内将它从休眠状态回复到发育状态，使其能重新在鱼体上传播，从而为海水鱼类淀粉卵涡鞭虫病的研究提供便利。

5、淀粉卵涡鞭虫的收集和培养是能否进行实验的基础，但宿主鱼的个体差异给传代效果带来了太多不确定性，传代成本、寄生虫用量、时效性是需要考虑的关键问题。因此，确定宿主鱼的种类、淀粉卵涡鞭虫的最佳传代剂量，建立一套标准化传代系统至关重要。

6、淀粉卵涡鞭虫病俗称“海水鱼天鹅绒病”，是由淀粉卵涡鞭虫寄生于海水鱼类体表而引起的寄生虫病，该病具有发病速度快、死亡率高等特点，可造成巨大的经济损失，严重阻碍了中国海水鱼类工厂化养殖和池塘养殖业的健康发展。开展淀粉卵涡鞭虫的致病机理、药物研制等研究均需大量虫体样本，然而在淀粉卵涡鞭虫的研究中要随时获得足够的材料是很困难的，因为自然条件下淀粉卵甲藻病的爆发是受季节严格限制的，疾病爆发的不确定性导致材料的获得没有保障，因此开展淀粉卵涡鞭虫的在体培养研究至关重要。

7、为了获得足够的寄生虫材料用于研究，很多研究者在实验室进行了寄生虫的培育，但是使用不同的宿主鱼建立起来的传代系统均存在一点的缺陷，导致寄生虫的产量低，对进一步研究工作造成了制约，因此建立一套高效的淀粉卵涡鞭虫传代系统十分重要。

8、在寄生虫的传代过程中存在一些问题，例如传代过程不能间断，即使在不需要实验材料的时候，寄生虫的传代工作也必须要进行下去，这就造成了经济和时间的巨大浪费。并且在传代过程中发现淀粉卵涡鞭虫的活力会随传代次数增加而降低。因此亟需找到合适的方法对淀粉卵涡鞭虫进行离体保存。

技术实现思路

1、本发明为解决上述问题，提供一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法。

2、本发明目的在于提供一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，具体包括如下步骤：

3、s1.感染宿主鱼：选取健康的宿主鱼，在自然条件下以淀粉卵涡鞭虫感染宿主鱼，得到患病宿主鱼；

4、s2.淀粉卵涡鞭虫胞囊的在体培养：制作淀粉卵涡鞭虫的收虫装置，并灌入盐度为19～21‰、水温为26～30℃的海水，将所述患病宿主鱼放入所述淀粉卵涡鞭虫的收虫装置中，保持对所述患病宿主鱼的供氧，每隔3～5h收集一次淀粉卵涡鞭虫胞囊；

5、s3.淀粉卵涡鞭虫胞囊的离体保存：将收集的淀粉卵涡鞭虫胞囊置于12～15℃条件下恒温保存；

6、s4.淀粉卵涡鞭虫的快速传代：将恒温保存的淀粉卵涡鞭虫胞囊取出，在26～28℃下孵化，孵化后进行快速传代。

7、优选的，步骤s1中感染的标准化剂量为1.8×105～2.7×105涡孢子/鱼；所述宿主鱼为金鲳鱼、大黄鱼或斑石鲷。

8、优选的，步骤s2中淀粉卵涡鞭虫的收虫装置包括养殖容器、漏斗、培养皿、供氧设备、进水口及出水口；

9、所述养殖容器上部设有进水口、下部设有带排水阀的出水口，所述进水口和所述出水口用于更换海水；

10、所述漏斗置于所述养殖容器内，所述漏斗底部与所述培养皿之间通过一个倒置的带盖瓶体连接，所述培养皿置于瓶盖内；通过所述培养皿收集所述淀粉卵涡鞭虫胞囊；

11、所述供氧设备的进气口伸入所述漏斗内，当需要供氧时，打开供气阀，氧气通过所述进气口的气石均匀释放至海水中；

12、使用时，将所述患病宿主鱼放入所述漏斗内，并保证所述漏斗内的海水水平面低于所述漏斗上沿。

13、优选的，步骤s2中通过所述培养皿收集所述淀粉卵涡鞭虫胞囊后，轻轻旋动培养皿使所述淀粉卵涡鞭虫胞囊集中，再吸取所述淀粉卵涡鞭虫胞囊转移至含干净海水的培养皿中洗涤，重复洗涤多次去除杂质。

14、优选的，步骤s2中海水的盐度为20‰、水温为27±0.5℃。

15、优选的，海水在使用前进行过滤、暗沉淀及高温灭菌处理，同时加入青霉素和链霉素防止所述患病宿主鱼的细菌感染。

16、优选的，步骤s3中的恒温保存的时间为13～20天。

17、优选的，步骤s4中的孵化温度为27℃。

18、优选的，宿主鱼的感染方法包括：将所述宿主鱼放入海水，加入脱胞1小时内的淀粉卵涡鞭虫的涡孢子，在黑暗条件下对所述宿主鱼进行感染，感染期间关闭充氧设施。

19、优选的，感染的标准化剂量为2.4×105涡孢子/鱼；所述宿主鱼选择金鲳鱼。

20、与现有技术相比，本发明能够取得如下有益效果：

21、本发明淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法建立了一套高效的淀粉卵涡鞭虫传代系统，解决了淀粉卵涡鞭虫材料的来源问题；与以往培养方法相比，成本低、操作简单，只需将患淀粉卵涡鞭虫病的金鲳移入收虫装置中数小时就可以收集到脱落的营养体；

22、收集胞囊后及时将患病金鲳进行治疗，可节约宿主鱼且降低成本；

23、通过本发明可以对淀粉卵涡鞭虫进行标准化和量化培养，获得大量具稳定感染力的淀粉卵涡鞭虫；

24、成功解决了淀粉卵涡鞭虫离体保存的问题，还为其它相似寄生虫的保存提供了参考。

技术特征：

1.一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述步骤s1中感染的标准化剂量为1.8×105～2.7×105涡孢子/鱼；所述宿主鱼为金鲳鱼、大黄鱼或斑石鲷。

3.根据权利要求2所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述步骤s2中淀粉卵涡鞭虫的收虫装置包括养殖容器、漏斗、培养皿、供氧设备、进水口及出水口；

4.根据权利要求3所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述步骤s2中通过所述培养皿收集所述淀粉卵涡鞭虫胞囊后，轻轻旋动培养皿使所述淀粉卵涡鞭虫胞囊集中，再吸取所述淀粉卵涡鞭虫胞囊转移至含干净海水的培养皿中洗涤，重复洗涤多次去除杂质。

5.根据权利要求4所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述步骤s2中海水的盐度为20‰、水温为27±0.5℃。

6.根据权利要求5所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述海水在使用前进行过滤、暗沉淀及高温灭菌处理，同时加入青霉素和链霉素防止所述患病宿主鱼的细菌感染。

7.根据权利要求6所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述步骤s3中的恒温保存的时间为13～20天。

8.根据权利要求7所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述步骤s4中的孵化温度为27℃。

9.根据权利要求8所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述宿主鱼的感染方法包括：将所述宿主鱼放入海水，加入脱胞1小时内的淀粉卵涡鞭虫的涡孢子，在黑暗条件下对所述宿主鱼进行感染，感染期间关闭充氧设施。

10.根据权利要求9所述的一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法，其特征在于：所述感染的标准化剂量为2.4×105涡孢子/鱼；所述宿主鱼选择金鲳鱼。

技术总结本发明涉及原生鞭毛虫传代培养技术领域，尤其涉及一种淀粉卵涡鞭虫的快速传代培养方法。包括：选取健康的宿主鱼，在自然条件下以淀粉卵涡鞭虫感染宿主鱼，得到患病宿主鱼；制作淀粉卵涡鞭虫的收虫装置，并灌入盐度为19～21‰、水温为26～30℃的海水，将所述患病宿主鱼放入所述淀粉卵涡鞭虫的收虫装置中，保持对所述患病宿主鱼的供氧，每隔3～5h收集一次淀粉卵涡鞭虫胞囊；将收集的淀粉卵涡鞭虫胞囊置于12～15℃条件下恒温保存；将恒温保存的淀粉卵涡鞭虫胞囊取出，在26～28℃下孵化，孵化后进行快速传代。优点在于：培养成本降低、操作简单方便，有利于标准化及获得大量具稳定感染力的淀粉卵涡鞭虫，为研究提供充足样本。技术研发人员：孙俊龙,骆剑,周晓莉,方耿辉,宋飞彪受保护的技术使用者：海南大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20