测定人脑脊液中多黏菌素E1和多黏菌素E2浓度的方法

本发明涉及药物分析，具体涉及一种测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法。

背景技术：

1、多黏菌素e甲磺酸盐是一种前体药物，需要在体内水解成活性黏菌素才具有抗菌活性。多黏菌素e是一种浓度依赖性的抗生素，其主要活性成分为多黏菌素e1和多黏菌素e2。在临床上，多黏菌素e主要用于治疗革兰氏阴性菌感染，抗菌谱主要包括鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌。多黏菌素已成为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后一道防线。多黏菌素e分子量大，静脉注射的多黏菌素e很难穿过血脑屏障，单独静脉滴注应用很难达到治疗效果。多项研究表明，鞘内/脑室内注射联合静脉滴注抗生素是治疗中枢神经系统感染多重耐药革兰氏阴性菌的最佳选择。为了保证脑脊液中获得有效的抗生素浓度，并减少副作用，监测脑脊液中的药物浓度十分必要。

2、脑脊液属于细胞外液，含少量蛋白质。与血浆不同的是，脑脊液中含有一部分的水溶性盐。蛋白沉淀法很难从脑脊液基质中除去盐和一部分脂质，这样会产生严重的基质效应，影响检测结果的重现性和准确性。目前国内外对人脑脊中多黏菌素e1和多黏菌素e2的测定方法报道极少，比如文章“pharmacokinetics of colistin in cerebrospinal fluidafter intraventricular administration alone in intracranial infections”，该方法的脑脊液前处理中使用硫酸沉淀蛋白，对色谱柱及质谱仪器具有一定的损害，不适宜临床长期应用。

技术实现思路

1、本发明提供一种测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，该分析方法准确度高，最低检测限低，分析时间短，适宜临床样本的大批量检测。

2、为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其包括以下步骤：

3、1)取系列浓度的多黏菌素e1和多黏菌素e2工作液分别与空白脑脊液混合，得到脑脊液样品；

4、2)采用盐析辅助液液萃取的方法对脑脊液样品进行预处理；

5、3)采用lc-ms/ms进样分析。

6、优选的，所述的脑脊液样品进行预处理包括：

7、1)在脑脊液样品标准曲线浓度范围内，内标液的浓度为20μg/ml；

8、2)盐析辅助液液萃取的方法中，盐析剂为甲酸铵；

9、3)盐析辅助液液萃取的方法中，萃取剂为含1％甲酸的乙腈；

10、4)脑脊液样品体积与萃取剂体积比为1:3。

11、优选的，所述的空白脑脊液由人工脑脊液代替。

12、优选的，所述的盐析剂的体积为100μl，浓度为2mol/l。

13、优选的，内标液为多黏菌素b1。

14、优选的，所述的内标液为含1％甲酸的纯水配制的储备液，继续用含1％甲酸的纯水稀释成多黏菌素b1的工作液浓度为20μg/ml。

15、优选的，所述的脑脊液体积为100μl，萃取剂为300μl的含1％甲酸的乙腈。

16、优选的，所述的lc-ms/ms进样分析采用内标法，以多黏菌素e1或多黏菌素e2和内标多黏菌素b1的色谱面积比为纵坐标y轴，以人脑脊液中多黏菌素e1或多黏菌素e2的浓度为横坐标x轴，建立标准曲线，根据标准曲线计算出待测人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2的浓度。

17、优选的，所述的标准曲线浓度如下：多黏菌素e1的六个脑脊液浓度点依次为：0.2μg/ml，0.50μg/ml，1.00μg/ml，2.00μg/ml，4.00μg/ml，8.00μg/ml；多黏菌素e2的六个脑脊液浓度点依次为：0.35μg/ml，0.88μg/ml，1.76μg/ml，3.53μg/ml，7.06μg/ml，14.12μg/ml。

18、优选的，高效液相色谱的色谱柱型号：xselect hss t3色谱柱；流动相a：乙腈；流动相b:含0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱模式：0-0.5min，95％-95％b；0.5-1min，95％-70％b；1-2.5min，70％-5％b；2.5-3min，5％-95％b；3.0-5.0min，95％-95％b；5.0-6.0min，95％-95％b。

19、本发明有益效果为：本发明建立了一种操作简便、成本低、前处理过程简单的方法来同时测定脑脊液中多黏菌素e1和e2浓度，该方法准确度高，重现性好，分析时间短，适宜临床样本的大批量检测。该方法已成功应用于临床患者脑脊液样本中多黏菌素e的测定，有助于优化个体给药方案。

技术特征：

1.一种测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的脑脊液样品进行预处理包括：

3.根据权利要求1所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的空白脑脊液由人工脑脊液代替。

4.根据权利要求2所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的盐析剂的体积为100μl，浓度为2mol/l。

5.根据权利要求2所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，内标液为多黏菌素b1。

6.根据权利要求2所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的内标液为含1％甲酸的纯水配制的储备液，继续用含1％甲酸的纯水稀释成多黏菌素b1的工作液浓度为15μg/ml。

7.根据权利要求2所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的脑脊液体积为100μl，萃取剂为300μl的含1％甲酸的乙腈。

8.根据权利要求1所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的lc-ms/ms进样分析采用内标法，以多黏菌素e1或多黏菌素e2和内标多黏菌素b1的色谱面积比为纵坐标y轴，以人脑脊液中多黏菌素e1或多黏菌素e2的浓度为横坐标x轴，建立标准曲线，根据标准曲线计算出待测人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2的浓度。

9.根据权利要求8所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，所述的标准曲线浓度如下：多黏菌素e1的六个脑脊液浓度点依次为：0.2μg/ml，0.50μg/ml，1.00μg/ml，2.00μg/ml，4.00μg/ml，8.00μg/ml；多黏菌素e2的六个脑脊液浓度点依次为：0.35μg/ml，0.88μg/ml，1.76μg/ml，3.53μg/ml，7.06μg/ml，14.12μg/ml。

10.根据权利要求1所述的测定人脑脊液中多黏菌素e1和多黏菌素e2浓度的方法，其特征在于，高效液相色谱的色谱柱型号：xselect hss t3色谱柱；流动相a：乙腈；流动相b:含0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱模式：0-0.5min，95％-95％b；0.5-1min，95％-70％b；1-2.5min，70％-5％b；2.5-3min，5％-95％b；3.0-5.0min，95％-95％b；5.0-6.0min，95％-95％b。

技术总结本发明涉及化学药物分析领域，具体涉及一种测定人脑脊液中多黏菌素E1和多黏菌素E2浓度的方法，本发明采用盐析辅助液液萃取的方法，用乙腈作为萃取剂，甲酸铵作为盐析剂，并成功应用于人脑脊液样品中的多黏菌素E1和多黏菌素E2浓度的测定。本发明的方法灵敏度高，特异性强，重现性高，前处理过程简单，6mi n之内完成脑脊液中多黏菌素E1和多黏菌素E2药物的定量分析，准确度和精密度满足要求，可用于临床上脑脊液中多黏菌素E1和多黏菌素E2药物浓度检测提供简单快速的检测方法。技术研发人员：王琴会,杨乐,杨义帆,唐秀玲,张文娟受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20