抗血清白蛋白的纳米抗体及其衍生物和应用的制作方法

本技术涉及一种抗血清白蛋白的纳米抗体及其衍生物和应用，属于抗体技术和生物医药。

背景技术：

1、生物制品已广泛应用于疾病的预防、诊断和治疗，如疫苗、血液制品、生物技术药物和核酸类药物。然而，其中的蛋白和多肽相关药物在血清中半衰期较短，而无法达到预期功效。蛋白和多肽的清除过程包括：体内的蛋白酶降解和肾小球过滤。为了达到有效的治疗效果，往往采用高频次、高剂量或长时间用药，这可能导致药物的副作用增加和患者用药依从性差。

2、延长药物半衰期主要策略包含以下几种（参考高晓娟. 采用融合白蛋白结合域和fcrn结合域改善cd47纳米抗体体内代谢动力学[d].2020和[2]魏莹, 张哲文, 陆亚敏等.长效重组蛋白药物发展动态. 生物工程学报, 2018, 34(3): 360-368）：（1）对蛋白或多肽进行突变，以降低对水解酶的敏感性，增强蛋白或多肽的稳定性，但很多半衰期延长的突变体会改变药物的活性；（2）增加蛋白质或肽的尺寸和流体动力学半径，如：聚乙二醇化（pegylation，peg），peg化被认为是安全且耐受性良好的，但在一些研究中发现，由于肾脏中积聚了不可降解的聚乙二醇链，在肾小管中发现空泡化现象；（3）利用fcrn（neonatal fcreceptor，新生儿fc受体）介导的再循环机制，延长药物半衰期。人血清白蛋白（humanserum albumin，hsa）是血液中的一种天然转运蛋白，其分子量为66.5 kda，是人体血浆内含量最为丰富的蛋白质。hsa主要生理功能之一是参与多种内源性和外源性物质的运输、分布与代谢等。hsa具有较长的半衰期（约19天）、生物降解性、非免疫原性和生物相容性，被广泛应用于小分子化药、多肽、蛋白、核酸等多种治疗药物的递送。hsa能够以单分子的形式载药，如将治疗药物通过非共价、共价、基因融合的方式连接到hsa分子上。现如今hsa已成功地用于生产各种融合蛋白，例如将其与激素和细胞因子结合，以调节药代动力学特性，从而提高这些分子的治疗效果。hsa-多肽的融合方式大大增加了多肽类生物药物的分子量，给生产和转化带来了很多问题，分子量的增加也会改变药物的某些药代动力学特性，可能使其难以达到靶点所在位置，进而影响药效（参考李荣，胡维新. 血清白蛋白的生物学特性研究进展[j].生命科学,2013, 25(10): 1022-1026和陈重，野庆松，吴锦慧. 基于人血清白蛋白的药物递送系统研究进展[j]. 药学进展, 2022, 46(7): 495-501）。

3、1993年，hamers等人首次发现骆驼血液中存在一种缺失传统抗体的轻链和重链恒定区ch1区域的重链抗体。重链抗体的重链可变域片段称为vhh ( variable domain ofheavy chain of heavy-chain antibody，vhh) 。对vhh进行克隆并重组表达，获得只含有单个结构域的最小单元抗原结合片段，即为单域抗体(single-domain antibodies，sdabs)，亦被称为纳米抗体(nanobody)。其具有尺寸小、结构简单且免疫原性低，水溶性高，稳定性强，高特异性，高亲和力，耐高温、强酸、强碱，耐压力和不易聚集等特点（参考孙山，谭星，庞晓燕等. 纳米抗体技术应用的最新进展[j].生物工程学报, 2022, 38(3): 855-867）。ablynx公司作为纳米抗体领域的领军企业，其cablivi ( caplacizumab-yhdp ) 纳米抗体药物为全球首个获批的强效选择性双价抗血管性血友病因子（vwf）纳米抗体（参考sean duggan. caplacizumab: first global approval[j].drugs. 2018 oct;78(15):1639-1642）。

4、利用抗原抗体特异性结合的特点，将蛋白药物与人血清白蛋白的特异性抗体的结合功能区融合在一起制成融合蛋白，能够有效提高蛋白和多肽药物的半衰期。由ablynx/赛诺菲开发的已获批上市的人源化、三价的双特异性纳米抗体ozoralizumab，其含有两个靶向tnf-α（tumor necrosis factor-α，肿瘤坏死因子α）的纳米抗体和一个靶向人hsa的纳米抗体，其中靶向hsa主要是为了增加抗体的半衰期（参考tsutomu takeuchi, masafumikawanishi, megumi nakanishi ,et al. phase ii/iii results of a trial of anti–tumor necrosis factor multivalent nanobody compound ozoralizumab in patientswith rheumatoid arthritis[j] arthritis rheumatol . 2022 nov;74(11):1776-1785）。ablynx已经有多款产品是以抗人血清白蛋白为长效因子而构建的融合蛋白，例如靶点为il-6r（interleukin-6 receptor，白介素6受体）（参考maarten van roy, cedricververken, els beirnaert, et al. the preclinical pharmacology of the highaffinity anti-il-6r nanobody® alx-0061 supports its clinical development inrheumatoid arthritis[j]. arthritis res ther. 2015 may 20;17(1):135.）和rankl（receptor activator of nuclear factor-κ b ligand，核因子κ b受体活化因子配体）（参考schoen p, jacobs s, verschueren k, ottevaere i, sobry s&holz jb (2013)anti-rankl nanobody alx-0141 shows sustained biomarker inhibition in a phasei study in healthy postmenopausal women. european calcified tissue societycongress, lisbon, portugal.）。尽管ablynx公司开发了此类单域抗体应用于长效性蛋白药物开发，且已有几篇专利文献报道了针对人血清白蛋白的纳米抗体（参考张大挺. 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用: 202210227069.2[p].2022-09-13和b 爱德华兹, d平托. 结合人血清白蛋白的单结构域抗体: 201980088164.5[p]. 2021-09-17），但对此类抗体的差异性开发，如：针对不同抗原表位、抗体亲和力不同或抗体结构（序列）不一致，为长效性蛋白药物的开发奠定了基础。因此，本发明通过定期免疫骆驼，使其产生抗人白蛋白的特异性抗体，利用噬菌体展示技术进行淘选，并通过酵母和大肠杆菌进行表达，最终得到具高亲和力的抗人白蛋白的单域抗体，该单域抗体为延长生物药物的半衰期奠定基础，有利于提高生物药在治疗中的有益效果。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，提供了一种抗血清白蛋白的纳米抗体及其衍生物和应用，本技术公开的抗血清白蛋白的纳米抗体，与白蛋白具有高亲和力，可用于延长生物药物的半衰期，有利于提高生物药在治疗中的有益效果。

2、根据本技术的一个方面，提供了一种抗血清白蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体能够特异性结合血清白蛋白，且所述纳米抗体具有如下的互补决定区cdr：

3、seq id no.2所示的cdr1、seq id no.3所示的cdr2、seq id no.4所示的cdr3。

4、可选的，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、根据本技术的另一个方面，提供了编码上述纳米抗体的核酸分子。

6、可选的，所述核酸分子包括如seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列。

7、需要说明的是，对于本领域技术人员而言可以理解，上述两个核苷酸序列为本领域技术人员基于seq id no.1所示的氨基酸序列根据毕赤酵母或大肠杆菌的密码子优化获得，本领域技术人员可以进行其他优化，或者根据不同的表达工程菌进行优化，可以理解的是，编码本技术上述纳米抗体的核酸分子都应在本技术的保护范围之内。

8、根据本技术的另一个方面，提供了表达上述纳米抗体的载体。

9、可选的，所述载体包含如seq id no.5或seq id no.6所示的核苷酸序列。

10、可选的，所述载体选自ppiczα a或pet-32a(+)。

11、根据本技术的另一个方面，提供了表达上述纳米抗体的宿主细胞。

12、可选的，所述宿主细胞包含上述的核酸分子，和/或上述的载体。

13、可选的，所述宿主细胞为工程菌，所述工程菌选自毕赤酵母或大肠杆菌。

14、可选的，所述工程菌选自毕赤酵母x-33或大肠杆菌bl-21。

15、根据本技术的另一个方面，提供了包含上述纳米抗体氨基酸序列seq id no.1作为vhh链的抗血清白蛋白抗体。

16、可选的，所述抗体为包含上述的纳米抗体的双特异性或多特异性抗体。

17、根据本技术的另一个方面，提供了包含上述纳米抗体和上述抗体的融合蛋白。

18、可选的，所述融合蛋白为上述纳米抗体或上述抗体与多肽或蛋白融合构建而成。

19、根据本技术的另一个方面，提供了上述纳米抗体或上述抗体的衍生物，所述衍生物包括与上述纳米抗体或上述抗体通过共价键或非共价键结合的修饰物。

20、可选的，所述通过非共价键结合的修饰物选自胶体金、胶体银或胶体碳。

21、可选的，所述通过共价键结合的修饰物选自彩色微球、荧光微球、磁微球、层析填料或化学小分子，所述化学小分子选自生物素、染料分子或荧光分子。

22、根据本技术的另一个方面，提供了上述纳米抗体或上述抗体或上述纳米抗体或抗体的衍生物的用途，用于制备：a）分离纯化血清白蛋白的磁微球或层析填料，b）定性或定量检测血清白蛋白的检测试剂盒。

23、根据本技术的另一个方面，提供了包含上述纳米抗体或抗体及其衍生物的缀合物，所述缀合物包括连接的治疗剂。

24、根据本技术的另一个方面，提供了包含上述纳米抗体或抗体及其衍生物的药物组合物。

25、可选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

26、根据本技术的另一个方面，提供了一种延长药物体内半衰期的方法，所述方法包括将上述的纳米抗体与药物进行连接的步骤。

27、根据本技术的另一个方面，提供了一种制备上述纳米抗体的方法，所述方法包括在适合培养的条件下培养上述宿主细胞，并分离出纳米抗体的步骤。

28、本发明通过筛选得到一种能够高特异性识别人白蛋白的纳米抗体，该纳米抗体与白蛋白的亲和力高，可用于延长药物在体内的半衰期。

29、本发明还提供了该纳米抗体以毕赤酵母和大肠杆菌为宿主细胞的两种表达制备方法，有利于实现商业化生产。