一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂及其制备方法和应用

本发明涉及微生物，尤其涉及一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、大黄鱼是中国重要的海水养殖鱼类，尤其在福建省宁德市的产量占全国80%以上。近年来，病害如内脏白点病、体表白点病和白鳃病等严重威胁大黄鱼养殖业。特别是由变形假单胞菌（ pseudomonas plecoglossicida）引起的内脏白点病，能在不同年龄的大黄鱼中引起感染，表现为内脏器官出现白色结节，发病温度通常在12-20℃，具有较高的死亡率。目前，抗生素是防治该病的主要手段，但滥用抗生素导致耐药性和药物残留问题日益严重。因此，开发新的绿色防控策略，特别是疫苗，对于防控大黄鱼内脏白点病至关重要。然而，变形假单胞菌在冻干过程中，细胞容易受到损伤，导致活性下降。为了提高冻干后细胞的活性和稳定性，需要一种有效的冻干保护剂。甘油保存细菌前期存活率高，但随着保存时间的增加，甘油菌存活率大幅下降，且细菌复活所需培养时间越来越长，而冻干保存的细菌存活率不前期如甘油保存高，但随着保存时间的增加，其存活率降幅较小，且细菌复活所需培养时间比甘油菌短，由此可知，相较超低温保藏技术而言，冷冻干燥技术在海水养殖病原菌菌种长期保存过程中的稳定性较好。因此选择冻干保存比较利于细菌长时间保存。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂及其制备方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂，所述冻干保护剂以质量分数计包括：5%~7.5%乳糖，0~5%甘露醇，0~5%海藻糖，10%~15%脱脂乳粉，0~0.5%维生素c，0~0.5%明胶，0~3%山梨醇，0~1%甘油，0~2% l-抗坏血酸钠，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。

4、优选的，上述冻干保护剂以质量分数计包括：7.5%乳糖，5%甘露醇，5%海藻糖，1%甘油，10%脱脂乳粉，0.5%维生素c，0.5%明胶，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。

5、上述一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂，其是将乳糖、甘露醇、海藻糖、甘油、脱脂乳粉和明胶溶于灭菌的1wt%氯化钠溶液中，在106℃条件下湿热灭菌30min，自然冷却，获得溶液a；将维生素c溶于灭菌的1wt%氯化钠溶液中，经0.22μm混合纤维素滤膜过滤，获得溶液b；将溶液a和溶液b在无菌条件下混合，振荡均匀，获得冻干保护剂；所述冻干保护剂以质量分数计包括：7.5%乳糖，5%甘露醇，5%海藻糖，1%甘油，10%脱脂乳粉，0.5%维生素c，0.5%明胶，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。

6、上述的冻干保护剂在变形假单胞菌冻干保存中的应用。

7、一种制备变形假单胞菌冻干粉的方法，其是使用上述的冻干保护剂制备变形假单胞菌冻干粉。

8、上述一种制备变形假单胞菌冻干粉的方法，具体是将变形假单胞菌菌液离心，弃上清，获得菌体沉淀；将菌体沉淀用灭菌的1wt%氯化钠溶液洗涤2次，然后用灭菌的1wt%氯化钠溶液重悬，获得变形假单胞菌重悬液；将变形假单胞菌重悬液与上述的冻干保护剂混合，进行冻干，获得变形假单胞菌冻干粉；

9、其中，变形假单胞菌重悬液与冻干保护剂的体积比为1：1；

10、冻干的工艺条件为：先在-80℃条件下预冻6h，然后转入冻干机中，在0.100mbar压力、-60℃条件下冷冻干燥20~24h。

11、一种变形假单胞菌冻干粉，所述变形假单胞菌冻干粉是使用上述的方法制备得到。

12、本发明的显著优点在于：

13、本发明提供了一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂，该冻干保护剂能够显著提高冻干后细胞的活性和稳定性。本发明还提供了该冻干保护剂的制备方法及其在变形假单胞菌冻干保存中的应用。利用该冻干保护剂制备的变形假单胞菌冻干粉，具有体积小、含菌量高、稳定性高、保存时间长、便于保藏、运输，使用方便等优点，在-80℃条件下储藏半年后的活菌存活率可达到30％以上。本发明可为变形假单胞菌减毒疫苗保存提供理论基础，具有重要的意义和应用价值。

技术特征：

1.一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂以质量分数计包括：5%~7.5%乳糖，0~5%甘露醇，0~5%海藻糖，10%~15%脱脂乳粉，0~0.5%维生素c，0~0.5%明胶，0~3%山梨醇，0~1%甘油，0~2% l-抗坏血酸钠，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂以质量分数计包括：7.5%乳糖，5%甘露醇，5%海藻糖，1%甘油，10%脱脂乳粉，0.5%维生素c，0.5%明胶，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。

3.如权利要求2所述的冻干保护剂的制备方法，其特征在于：将乳糖、甘露醇、海藻糖、甘油、脱脂乳粉和明胶溶于灭菌的1wt%氯化钠溶液中，在106℃条件下湿热灭菌30min，自然冷却，获得溶液a；将维生素c溶于灭菌的1wt%氯化钠溶液中，经0.22μm混合纤维素滤膜过滤，获得溶液b；将溶液a和溶液b在无菌条件下混合，振荡均匀，获得冻干保护剂；所述冻干保护剂以质量分数计包括：7.5%乳糖，5%甘露醇，5%海藻糖，1%甘油，10%脱脂乳粉，0.5%维生素c，0.5%明胶，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。

4.如权利要求1~2任一项所述的冻干保护剂在变形假单胞菌冻干保存中的应用。

5.一种制备变形假单胞菌冻干粉的方法，其特征在于：使用权利要求1~2任一项所述的冻干保护剂制备变形假单胞菌冻干粉。

6.根据权利要求5所述的一种制备变形假单胞菌冻干粉的方法，其特征在于：将变形假单胞菌菌液离心，弃上清，获得菌体沉淀；将菌体沉淀用灭菌的1wt%氯化钠溶液洗涤2次，然后用灭菌的1wt%氯化钠溶液重悬，获得变形假单胞菌重悬液；将变形假单胞菌重悬液与权利要求1~2任一项所述的冻干保护剂混合，进行冻干，获得变形假单胞菌冻干粉。

7.根据权利要求6所述的一种制备变形假单胞菌冻干粉的方法，其特征在于：所述变形假单胞菌重悬液与冻干保护剂的体积比为1：1。

8.根据权利要求6所述的一种制备变形假单胞菌冻干粉的方法，其特征在于：所述冻干的工艺条件为：先在-80℃条件下预冻6h，然后转入冻干机中，在0.100mbar压力、-60℃条件下冷冻干燥20~24h。

9.一种变形假单胞菌冻干粉，其特征在于：所述变形假单胞菌冻干粉是使用权利要求5~8任一项所述的方法制备得到。

技术总结本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于变形假单胞菌的冻干保护剂及其制备方法和应用。所述冻干保护剂以质量分数计包括：5%~7.5%乳糖，0~5%甘露醇，0~5%海藻糖，10%~15%脱脂乳粉，0~0.5%维生素C，0~0.5%明胶，0~3%山梨醇，0~1%甘油，0~2%L‑抗坏血酸钠，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。优选的，所述冻干保护剂以质量分数计包括：7.5%乳糖，5%甘露醇，5%海藻糖，1%甘油，10%脱脂乳粉，0.5%维生素C，0.5%明胶，余量为灭菌的1wt%氯化钠溶液。使用所述冻干保护剂制备的变形假单胞菌冻干粉，在‑80℃条件下储藏半年，变形假单胞菌的存活率可达到30％以上。技术研发人员：陈新华,覃盼,杨金梅,张伟妮受保护的技术使用者：福建农林大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20