一种快速检测BEFV和MRV的方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种快速检测befv和mrv的方法。

背景技术：

1、牛流行热的病原体为牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus，befv),在1994年ictv会议将牛流行热病毒列为暂时热病毒属，此病归于弹状病毒科，之后在2015年国际病毒分类委员会(ictv)最新发布的病毒分类系统中，弹状病毒科被分为13个属，其中就包括了狂犬病病毒属(lyssavirus)、暂时热病毒属(ephemerovirus)、水泡病毒属(vesiculovirus)、鲈鱼弹状病毒属(perhabdovirus)等。这些病毒都有共性，如外观形状呈子弹型、对脂类和乙醚敏感、rna为单股负链等。

2、befv主要易感动物是黄牛，不同性别、品种、年龄的牛都能感染上这个病，水牛相比其他牛的感染率来说是比较低的，妊娠母牛感染后临床症状严重如会发生流产、产死胎现象。这种疾病主要是通过蚊子、蠓和白蛉等吸血昆虫叮咬患病的牛，然后病毒通过这些昆虫的口部和血液进入它们的体内，并有可能再次叮咬健康的牛，从而实现大规模的传播。

3、呼肠孤病毒科包含了一种名为哺乳动物正呼肠孤病毒(mrv)的成员，它与禽正呼肠孤病毒(arv)是正呼肠孤病毒家族的主要代表毒株。哺乳动物呼肠孤病毒属于rna病毒，它的特点是具有二十面体对称的复合双层外壳结构。即使是相同血清型的毒株，它们的致病性质也可能各不相同，更不用说不同血清型的毒株了。目前，已经识别出4个mrv血清型，包括lang(t1l)的血清型1、jones(t2j)的血清型2、dearing(t3d)的血清型3以及ndelle(t4n)的血清型4，它们均具有造成红细胞凝集的活性。

4、mrv的宿主范围很广泛，其中包括小鼠、猫、狒狒、狗、猪、牛、马、兔子、人类、猴子以及鸟类等，例如德国大雁和家禽呼肠孤病毒抗体阳性率为29％，鸭和鸡抗体阳性率也相当普遍。据报道，在年轻人的血清中也存在针对该病毒的抗体，这些抗体从粪便和呼吸道分泌物中分离出来，性质相对稳定。这表明呼肠孤病毒阳性主要通过受感染动物的粪便和口腔传播，同时也可以通过呼吸道传播。

5、mrv在自然界中分布广泛，主要存在于河水、未经处理的污水和储存水中，病毒的主要来源是人和动物的排泄物。正因如此，mrv常被用作水源是否被动物粪便污染的生物测试指标。已在美国、法国、加拿大、中国、印度尼西亚和马来西亚等各个国家的人群中检测到mrv，2007年10月在中国北京某奶牛场的犊牛腹泻粪便样品中分离获得一株mrv-1毒株，并且研究人员认为从美国分离出的mrv-3会导致儿童发生脑膜炎和腹泻。

6、对于牛流行热病和牛呼肠孤病的早期快速诊断非常重要，目前对这两种病毒同时进行检测的实验尚未见相关文献报道。现阶段我国对这两种病的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、中和试验、补体结合试验、免疫荧光等方法，虽然检测方法很多，但以上实验操作方法比较繁琐。由于牛流行热病毒和牛呼肠孤病毒都属于rna病毒，相对容易降解，为了避免更复杂的检测步骤，防止操作过程中受到污染，既如此,非常有必要建立一种快速、精准、经济且实惠的实验室诊断方法。本发明的目的旨在建立一种快速、简便、准确，能同时检测出befv和mrv的二重rt-pcr检测方法，为临床上快速诊断befv和mrv提供理论依据和技术支持。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种快速检测befv和mrv的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采取了如下技术方案：

3、一种快速检测befv和mrv的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、步骤(1)：分别取befv、mrv组织样本，分别将得到的befv和mrv基因组cdna为模板；

5、步骤(2)：根据1对befv特异性引物和一对mrv特异性引物进行扩增，其中，befv特异性引物分别为befv-45-f3和befv-45-b3，mrv特异性引物分别为mrv-185-f3和mrv-249-b3；其中，引物befv-45-f3的引物序列为gggattatgcatatttatttgagca；引物befv-45-b3的引物序列为tgttatgtccattcaattcttgt；引物mrv-185-f3的引物序列为gtcagtgagcttcgtagac；引物mrv-249-b3的引物序列为ggaattaccttctcaattactgc；

6、步骤(3)：对反应体系进行优化，优化结束后，进行实验，并加入pcr扩增产物继续实验，实验结束后，拿出凝胶块并放置在呈像仪上，应用产物条带进行扩增产物检测并判断结果；

7、步骤(4)：将得到的2种病毒基因组等体积混合，作为二重pcr反应的模板，对反应体系进行优化，使用引物对混合病毒模板进行二重pcr扩增，反应结束后，使用凝胶成像系统并根据产物条带判断结果。

8、优选的，所述步骤(1)中分别取befv、mrv组织样本的方法为：

9、步骤(a)：选取病变明显的组织块约20mg，依次加入150μl裂解液vlb、450μl实验室纯水和20μl蛋白酶k，用眼科剪反复多次剪碎混匀，置56℃水水浴中消化15-30分钟后瞬时离心取上清；

10、步骤(b)：将上述处理后样本离心取上清100μl转入1.5ml的离心管中，加入300μl裂解液vlb，立刻涡旋振荡并混匀；

11、步骤(c)：加入250μl无水乙醇，立刻涡旋振荡15秒充分混匀；

12、步骤(d)：将混合物加入一个吸附柱ra中，再把吸附柱放入收集管中，放于离心机中设置12，000rpm离心1分钟，之后弃掉废液；

13、步骤(e)：加500μl蛋白液re，12,000rpm离心30秒，弃废液；

14、步骤(f)：加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心30秒，弃掉废液，加入500μl漂洗液rw，重复一次此步骤；

15、步骤(g)：将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟；

16、步骤(h)：取出吸附柱ra，放入一个rnase free的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μl室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟；

17、步骤(i)：病毒离心管中所得液体即为检测所需的样本dna或rna，如需短期保存，dna病毒核酸可以存放可以放置在-20℃冰箱，rna病毒核酸立刻短期放置在-70℃超低温冰箱；

18、步骤(j)：将rna反转录成cdna。

19、优选的，所述步骤(3)中，对反应体系进行优化的方法为：

20、选用25μl的反应体系，建立各病毒单一pcr检测方法，并对反应的引物终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/l)及退火温度(50.0、50.7、52.6、55.3、56.8、58.2、60.6、62.0℃)进行优化。

21、优选的，所述步骤(3)中，优化结束后的实验方法为：

22、使用精密天平量取琼脂糖0.375g，加入锥形瓶中，倒入tae缓冲电泳液25ml，置于微波炉中中火加热1～2分钟，直到琼脂糖凝胶完全溶解后，再加入10μl goldview核酸染料，混匀倒入制胶模具中，最后放入加样梳，等待20分钟，彻底冷却后拿出加样梳，在第一孔中加入10μl dl 2000plus dna marker，之后依次加入10μl的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，等待18分钟。

23、优选的，所述步骤(4)中，对反应体系进行优化的方法为：

24、选用50μl体系，94℃2min(预变性)，94℃30s(变性)，56℃30s(退火温度)，72℃45s(延伸)，35个循环后，72℃2min(延伸)，分别对二重pcr反应方法的引物终浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/l)及退火温度(50.0、50.7、52.6、55.3、56.8、58.2、60.6、62.0℃)进行优化。

25、优选的，所述步骤(4)中，优化结束后的实验方法为：

26、进行琼脂糖凝胶的制备，等待20分钟后，再取10μl pcr扩增产物进行加样，加完后进行电泳实验。

27、本发明相对于现有技术取得了以下技术效果：

28、1、本发明初步建立的二重rt-pcr检测方法能够同时快速、准确地检测出befv和mrv，是国内首次建立的同时检测befv和mrv两种病的二重rt-pcr方法；

29、2、本发明建立的同时检测befv和mrv的二重rt-pcr方法特异性好，与牛支原体病(mbv)、牛副结核病(map)、牛副流感病毒3型(bpiv3)、牛呼吸道合胞体病毒(brsv)、牛鼻炎病毒(brv)不产生交叉反应；

30、3、本发明建立的同时检测befv和mrv的二重rt-pcr方法敏感性高，二重pcr方法最低检测限为1.0×10-4拷贝/μl；

31、4、本发明建立的同时检测befv和mrv的二重rt-pcr方法可用于临床诊断。