水稻种子活力基因OsRFP的dCAPS分子标记及其相关应用

本发明属于水稻育种及分子生物学，具体涉及水稻种子活力基因osrfp的dcaps分子标记及其相关应用。

背景技术：

1、水稻是全球最重要的三大粮食作物之一，世界上超过50％人群以稻米为主食，因此水稻的增产、稳产与全球粮食安全和社会稳定密切相关。水稻在贮藏过程中，种子内部会发生一系列的生理变化，从而导致种子活力降低、成苗率下降等现象；种子老化是指种子活力的自然衰退，在高温高湿的环境下会加速种子的老化进程。部分地区的水稻种子由于常年受季风性气候的影响，同时高温高湿的天气进一步加速了种子的老化进程。水稻种子的寿命和活力是鉴定稻米品质的重要指标之一，由于种子保存后的活力及发芽率降低等原因，如何提高水稻品种的种子活力是科研工作者的育种目标和研究重点。

2、东乡野生稻是迄今世界分布最北的普通野生稻(oryza rufipogon griff)，从东乡野生稻中发掘并利用水稻种子活力基因对促进水稻耐储性育种具有重要的实践意义。

3、种子活力不仅与自身发育、储藏条件等外界条件密不可分，同时也受到遗传控制。锌指蛋白(ring fingerprotein，rfp)家族是高等植物中最丰富的转录因子之一，锌指蛋白中的锌离子由半胱氨酸和组氨酸残基组合。根据组氨酸和半胱氨酸残基的位置和数量，主要分为c2h2、c2hc、c2hc5、c2c2、ccch、c3hc4、c4、c4hc3、c6和c8等类型，它们主要与转录调控、dna修复、细胞增殖及抗逆生理等生物学过程相关。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种用于筛选水稻种子活力基因osrfp的的dcaps分子标记以及检测该分子标记的引物及相关应用。本发明利用重测序技术在水稻第6号染色体上定位一个种子活力qtlqgss6(8929129-12724047)，其增效等位基因来自东乡野生稻。并在该区间研究发现一个来自锌指蛋白家族基因osrfp，且其在亲本间具有一个碱基的差异，进一步研究发现在东乡野生稻构建的bc5f2群体中检测该位点的lod值为2.9，pve为13.5％。为了进一步加快其在水稻种子活力育种中的应用，为此针对qgss6设计开发连锁的dcaps分子标记，对促进其在水稻品种种子活力分子鉴定和水稻种子活力分子标记辅助育种具有重要的应用价值。本发明致力于开发一种可以快速检测水稻种子活力的dcaps分子标记，进而加快水稻种子活力的分子育种应用。

2、为实现本发明的目的，首先利用水稻品种协青早b(种子活力弱)与东乡野生稻(种子活力强)杂交构建重组自交系(rils)群体，提取rils群体的基因组dna，利用重测序技术构建高密度的bin标记遗传连锁图谱，获得与水稻种子活力性状显著关联的snp位点，对上述snp位点连锁的片段进行克隆测序，并将其转化成dcaps分子标记，利用转化成功的dcaps分子标记在自然群体和上述重组自交系(rils)群体中进行水稻种子活力的鉴定，分子标记鉴定结果与表型鉴定结果一致。

3、基于此，本发明提供了一种水稻种子活力基因osrfp的dcaps分子标记，所述dcaps分子标记为gss6-dcaps；

4、所述dcaps分子标记gss6-dcaps的多态性位于水稻第6号染色体物理位置为10005526bp处，所述gss6-dcaps的多态性为a或g。

5、本发明还提供了一种用于检测上述dcaps分子标记gss6-dcaps的特异性引物对，所述特异性引物对的上游引物序列如seq id no.1所示：

6、tcaattgggctgtatgaagtggatc；

7、所述特异性引物对的下游引物序列如seq id no.2：

8、aacaaccttcatggaggtggtgctt所示。

9、本发明还提供了一种用于检测上述dcaps分子标记gss6-dcaps的试剂盒，所述试剂盒包括上述特异性引物对。在本发明提供的试剂盒中，还含有限制性内切酶bamh i。

10、本发明还提供了上述特异性引物对和/或上述试剂盒在水稻辅助育种中的应用。

11、本发明还提供了上述特异性引物对和/或上述试剂盒在鉴定水稻种子活力中的应用。

12、本发明提供了一种水稻种子活力的鉴定方法，所述鉴定方法包括以下步骤：

13、1)从水稻叶片中提取基因组dna；

14、2)以步骤1)中提取的基因组dna为模板，利用权利要求2所示的特异性引物对进行pcr扩增反应，得到pcr扩增产物；

15、3)使用限制性内切酶bamh i酶切步骤2)得到的pcr扩增产物，得到酶切产物，对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；

16、4)当电泳结果有且仅有208bp一条带时，snp位点的基因型为aa纯合型，则该水稻材料种子活力弱；

17、当电泳结果包含208bp和187bp两条主带，snp位点的基因型为ag杂合型，则该水稻材料种子活力为中间型；

18、当电泳结果只包含187bp的一条主带，snp位点的基因型为gg纯合型，则该水稻种子的活力强。

19、在本发明中，所述步骤2)中pcr扩增的反应体系为：2×tolo fasttaq premix 10μl、10pmol/μl的权利要求2所述的特异性引物对1μl和300～500ng/μl的水稻基因组模板dna1μl，加灭菌后的超纯水至20μl；

20、pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸10min；

21、所述步骤3)酶切时，每20μl酶切反应体系中包括：10μl pcr扩增产物、1μl bamh i和9μl蒸馏水；所述酶切的反应温度为37℃，酶切的反应时间为30min；

22、所述聚丙烯酰胺凝胶电泳时，取2μl酶切产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳。

23、本发明技术方案所实现的有益效果为：

24、本发明提供的鉴定水稻种子活力的分子标记可应用于水稻种子活力分子标记辅助育种，无需自然老化或人工老化处理等表型鉴定方式，可便捷高效筛选出强种子活力的水稻品种，节本增效，促进水稻育种进程，对于培育强种子活力水稻新品种具有重要的理论及实践意义。

技术特征：

1.一种水稻种子活力基因osrfp的dcaps分子标记，其特征在于，所述dcaps分子标记为gss6-dcaps；

2.一种用于检测权利要求1所述的dcaps分子标记gss6-dcaps的特异性引物对，其特征在于，所述特异性引物对的上游引物序列如seq id no.1所示，所述特异性引物对的下游引物序列如seq id no.2所示。

3.一种用于检测权利要求1所述的dcaps分子标记gss6-dcaps的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的特异性引物对。

4.权利要求2所述的特异性引物对和/或权利要求3所述的试剂盒在水稻辅助育种中的应用。

5.权利要求2所述的特异性引物对和/或权利要求3所述的试剂盒在鉴定水稻种子活力中的应用。

6.一种水稻种子活力的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中pcr扩增的反应体系为：2×tolo fasttaq premix 10μl、10pmol/μl的权利要求2所述的特异性引物对1μl和300～500ng/μl的水稻基因组模板dna 1μl，加灭菌后的超纯水至20μl；

技术总结本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及水稻种子活力基因OsRFP的dCAPS分子标记及其相关应用。所述的dCAPS分子标记位于水稻6号染色体上物理位置为10005526bp处，其多态性为A/G。针对上述位点，本发明还提供了dCAPS分子标记相关的特异性引物对。利用该引物对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳检测，发现扩增条带大小为187bp的水稻种子活力强。本发明对于筛选和分子标记辅助选育强种子活力水稻品种具有重要应用价值。技术研发人员：吴婷,周诗琪,李霞,胡标林,王世林受保护的技术使用者：江西省农业科学院水稻研究所技术研发日：技术公布日：2024/8/20