猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光PCR检测方法

本发明属于分子生物学领域，涉及猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法。

背景技术：

1、猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,ped)是一种急性、高度接触性传染病，由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)引起，以感染猪呕吐、腹泻甚至脱水而死为典型特征，各年龄段猪均易被感染[2]，但仔猪感染后症状最为严重，致死率可以高达100％。

2、pedv属于冠状病毒科、冠状病毒属，为有囊膜的单股正链rna病毒，基因组全长约28kb，编码3个非结构蛋白(orf1a、orf1b和orf3)和4个结构蛋白(s、e、m和n)[10]。聚合酶链式反应(pcr)是扩增特定dna序列的强大工具[11]，但由于常规pcr无法准确定量，随后研发出实时聚合酶链式反应[12]，

3、可实时监测pcr反应进程，是核酸检测的首选经典方法。近年来研究发现，对常规taqman探针进行修饰可有效提高实时荧光定量pcr检测方法的特异性和敏感性。

4、锁核酸(lna)探针，是在taqman探针基础上选择性地将探针中的一些碱基修饰成lna碱基，极大提高了探针与目标序列的亲和力，稳定性、特异性和灵敏度更高。应用锁核酸探针荧光定量pcr检测m基因，将为猪流行性腹泻病毒的检测提供更加特异和灵敏的检测方法。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法。

2、本发明的目的通过下列技术方案实现：一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，包括用于扩增猪流行性腹泻病毒的1组特异性引物对和1条在引物对的扩增靶标区域内的lna-taqman探针。

3、所述的特异性引物对的序列如seq id no.1和seq id no.2所示。

4、所述的lna-taqman探针的序列如seq id no.3所示。

5、所述的lna-taqman探针的序列中，第7位的碱基“g”、第11位的碱基“a”、第13位的碱基“g”和第17位“a”均为锁核酸。

6、所述的lna-taqman探针在5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质。

7、所述的5′端标记荧光物质为标记fam。

8、所述的3′端标记淬灭物质为标记bhq1。

9、所述的检测试剂盒还包含阳性对照。

10、所述的阳性对照为包含猪流行性腹泻病毒m基因的重组质粒。

11、所述的重组质粒的载体为puc57。

12、上述猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法在鉴定和/或检测猪流行性腹泻病毒中的应用。

13、一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，包括如下步骤：

14、(1)提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总rna，使用试剂盒中的三对qpcr引物、相应的taqman探针及反应液进行检测：将所述的qpcr引物、相应的taqman探针及反应液置于qpcr反应体系中，进行pcr扩增，收集荧光信号；

15、(2)根据机器测算的荧光信号及ct值判断样品中是否有

16、pedv(fam)，ct＞35判定可疑，需重检。

17、优选地，步骤(1)中所述qpcr的步骤如下：使用one step primescripttm rt-pcrkit进行，其反应总体系为25ul，包括one step rt-pcr buffer iii(2×)12.5ul，takaraex taq hs(5u/ul)0.5

18、ul，primescript rt enzyme mix ii 0.5ul，浓度为10μmol/l的pedv-f、pedv-r0.6ul，浓度为10μmol/l的pedv-probe 0.3ul，模板rna 1ul、无核酶水加至25ul。

19、优选地，步骤(1)中所述qpcr反应程序如下：荧光通道设置为：fam，；反应条件为：42℃、5min，95℃、10s；

20、95℃、5s，50.5℃、30s，35℃、30s，扩增40个循环。

21、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

22、(1)本发明的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法是利用锁核酸的特点设计，对dna有强大的识别能力和亲和力，能够有效提高非洲猪瘟病毒野毒株的检测效率，降低漏检的概率。

23、(2)本发明的检测方法与现有的检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，比常规taqman探针荧光定量pcr方法的灵敏度高10倍，适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。

24、(3)本发明基于m基因的猪流行性腹泻病毒检测方法可用于猪流行性腹泻病毒精准检测。

技术特征：

1.一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，其特征在于包括用于扩增猪流行性腹泻病毒的1组特异性引物对和1条lna-taqman探针：

2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法检测组合物，其特征在于：所述的lna-taqman探针在5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质。

3.一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法检测组合物，其特征在于：所述的5′端标记荧光物质为标记fam，3′端标记淬灭物质为标记bhq1。

4.一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，其特征在于包括权利要求1-3任一项所述的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法检测组合物。

5.根据权利要求5所述的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，其特征在于：

6.根据权利要求6所述的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，其特征在于：所述的重组质粒的载体为puc57。

7.权利要求5、6或7所述的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法在猪流行性腹泻病毒精准检测中的应用。

8.一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，其特征在于包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光pcr检测方法，其特征在于：

技术总结本发明公开一种猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光PCR检测方法。本发明的检测组合物是利用锁核酸的特点设计，对DNA有强大的识别能力和亲和力，能够有效提高猪流行性腹泻病毒的检测效率，降低漏检的概率。本发明为猪流行性腹泻病毒检测提供了一种新的检测方法和检测试剂，与现有的检测方法相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，比常规TaqMan探针荧光定量PCR方法的灵敏度高10倍；可用于猪流行性腹泻病毒精准检测，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。技术研发人员：李艳,李春玲,翟少伦,卞志标,杨南玲受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物卫生研究所技术研发日：技术公布日：2024/8/20