一种重组乳酸菌及其在防治非洲猪瘟中的应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种重组乳酸菌及其在防治非洲猪瘟中的应用。

背景技术：

1、在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。

2、非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种高致死性传染病，对全球生猪养殖业构成了重大威胁。由于asfv的基因组庞大且复杂，大部分基因的功能尚未被完全解析，这大大阻碍了对其免疫机制的理解及有效药物和疫苗的开发。目前，尚未开发出有效的药物或疫苗来预防或治疗asf，使得该病毒的控制和防治异常困难。asfv具有显著的遗传多样性和强大的生存能力，能够抵抗极端的温度、酸碱度和化学试剂。其感染过程分为早期、中期和晚期，分别主要表达与病毒复制、颗粒结构相关的蛋白，并通过细胞膜发芽释放病毒颗粒。病毒的这些特性，加之频繁的遗传变异，导致了病毒株的多样化，使得动物感染后的临床症状多变，难以及时诊断。asf的传播途径多样，不仅包括家猪和野猪等主要宿主，还涉及软蜱、蚊牤等吸血昆虫，以及可能的非主要宿主如水蛭。感染动物的体液和受污染的土壤样本中都可以检出asfv的dna，病毒在多种内脏和组织中的检出以及在某些宿主体内的长期存活，进一步加剧了asf的防控难度。目前的疫苗研发面临着显著挑战。灭活疫苗在asfv感染中未能提供有效的保护，部分原因可能是由于asfv的复杂性和高度变异性。尽管有研究尝试通过使用戊二醛、去污剂或二元乙烯亚胺(bei)处理asfv来开发灭活疫苗，但这些方法未能达到预期的保护效果。与此同时，基于asfv特定蛋白(如p54、p30和p72)的亚单位疫苗和改进的dna疫苗构建策略显示出一定的保护潜力，但仍未能完全阻止感染。减毒疫苗的研究也取得了一些进展，通过体外或在非宿主动物体内的连续传代以及删除与病毒致病性相关的基因(如9gl、uk、cd2v、dp148r和mgfs)来开发疫苗。这些策略在动物模型中表现出一定的免疫效果，但安全性和稳定性仍是需要解决的关键问题。总而言之，asfv的复杂性、高度遗传变异性以及强大的生存能力使得开发有效的防治措施极具挑战。

技术实现思路

1、传统asf疫苗开发面临的主要挑战包括疫苗的安全性、免疫效果的一致性和持久性、以及生产成本。基于上述不足，本发明提供了一种融合基因，并基于此构建了包含并表达该融合基因的重组乳酸菌，该重组乳酸菌可制作防控asf的疫苗，利用重组乳酸菌作为活载体来表达asfv抗原融合蛋白。使用所述疫苗免疫动物，不仅能够有效地诱导特异性细胞免疫和体液免疫反应，而且通过口服给药，重组乳酸菌能够直接与宿主的黏膜免疫系统接触，促进黏膜免疫应答的产生，从而增强对非洲猪瘟病毒的全面防御能力。并且进一步地，本发明所述活载体疫苗还具有安全性和环境友好性。

2、具体地，本发明提供了下述的技术方案：

3、在本发明的第一方面，提供了一种融合基因，其包含：编码霍乱毒素b亚基(cholera toxin b subunit,ctb)的基因和选自编码p49蛋白的基因、编码p22蛋白的基因、编码蛋白k205r的基因、编码a137r蛋白的基因和编码e248r的蛋白的基因中的至少一个。在本发明的实施方式中，所述编码ctb的基因的核苷酸序列如seq id no:1中所示；所述编码p49蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no:2中所示；所述编码p22蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no:3中所示；所述编码k205r蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no:4中所示；所述编码a137r蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no:5中所示；所述编码e248r蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no:6中所示。

4、在本发明的一些实施方式中，所述融合基因由编码佐剂ctb的基因分别与编码蛋白p49、p22、k205r、a137r和e248r的基因融合得到。在本发明的一些实施方式中，所述融合基因中可以含有编码his-tag的基因。在本发明的一些实施方式中，所述融合基因中可以含有限制性内切酶识别位点序列，所述限制性内切酶比如xbai和/或hindiii，优选为同时含有xbai和hindiii。在本发明的一些实施方式中，所述融合基因中可以含有终止密码子。

5、在本发明的一些实施方式中，所述编码霍乱毒素b亚基(cholera toxin bsubunit,ctb)的基因通过连接子(linker)分别与编码p49蛋白的基因、编码p22蛋白的基因、编码k205r蛋白的基因、编码a137r蛋白的基因或编码e248r蛋白的基因相连。比如，在一种实施方式中，所述连接子的核苷酸序列如seq id no:7所示。在本发明的一些实施方式中，所述融合基因的核苷酸序列选自：如seq id no:8中所示的序列，如seq id no:9中所示的序列，如seq id no:10中所示的序列；如seq id no:11中所示的序列；如seq id no:12中所示的序列。本发明所述融合基因可采用常规的方法获得，比如，在本发明的一些实施方式中采用了无缝克隆技术。

6、在本发明的第二方面，提供了一种重组表达载体，其包含上述第一方面中所述的任一种融合基因。比如，在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体为重组质粒，其包含上述第一方面中所述的任一种融合基因和选自pet-28a和psip409-pgsa’的载体。其中，pet-28a可作为大肠杆菌原核表达的质粒载体；psip409-pgsa’可作为乳酸菌的表达载体。在本发明的一些实施方式中，所述载体为psip409-pgsa’时，所述重组质粒中的红霉素耐药基因erml被替换为天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶与丙氨酸消旋酶融合基因(asd-alr)。比如，可通过in-fution技术实现。将重组质粒中的红霉素耐药基因erml替换为asd-alr这一策略，旨在避免使用抗生素抗性基因，从而减少抗性基因可能转移到环境中其他微生物的风险，降低抗生素抗性的传播。有助于构建安全的基因工程微生物，适合于临床或食品级应用。此外，不使用抗生素抗性基因有利于提高公众对基因工程产品的接受度，并且在特定的营养缺陷型宿主中，这些经改造的微生物可以无需抗生素筛选就稳定存在，从而降低生产成本。

7、在本发明的第三方面，提供了一种用于防治非洲猪瘟的工程菌，其包含上述第一方面中所述的任一种融合基因，且能够在菌体表面表达产生非洲猪瘟病毒(asfv)抗原融合蛋白。在本发明的一些实施方式中，所述工程菌以乳酸菌或大肠杆菌为出发菌株。其中，所述乳酸菌优选为植物乳杆菌，更优选为丙氨酸消旋酶(alr)基因缺陷型植物乳杆菌nc8δalr。在本发明的一些实施方式中，所述工程菌为重组植物乳杆菌，它们可通过将上述第一方面中所述的任意一种融合基因插入表达载体psip409-pgsa’中，形成重组质粒，并将上述质粒中的erml红霉素耐药基因替换为asd-alr，将改造的重组质粒转入asd缺失型大肠杆菌χ6212中扩增，并进一步转入丙氨酸消旋酶基因(alr)缺陷型植物乳杆菌nc8δalr中获得。

8、在本发明的第四方面，提供了一种非洲猪瘟病毒(asfv)抗原融合蛋白，其由上述第一方面中所述的任一种融合基因编码或者由上述第三方面中所述的任一种工程菌表达产生。

9、在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物或药物制剂或饲料，其包含至少一种上述第四方面中所述的asfv抗原融合蛋白或至少一种上述第三方面中所述的工程菌。在本发明的一些实施方式中，所述工程菌以乳酸菌为出发菌株，所述乳酸菌优选为植物乳杆菌，更优选为丙氨酸消旋酶基因缺陷型植物乳杆菌nc8δalr。在本发明的一些实施方式中，所述工程菌能够在菌株表面表达产生asfv抗原融合蛋白。

10、比如，在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物或药物制剂或饲料中可以包含上述第四方面中所述的任意一种asfv抗原融合蛋白或多种的组合。

11、比如，在本发明的一些实施方式中，所述组合物中包含一种或多种上述第三方面所述的工程菌，所述工程菌中整合有融合基因，所述融合基因由编码佐剂ctb的基因分别与编码蛋白p49蛋白的基因、编码p22蛋白的基因、编码k205r蛋白的基因、编码a137r蛋白的基因和编码e248r蛋白的基因融合得到。比如，在一种实施方式中，所述融合基因的核苷酸序列如seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11或seq id no:12中所述。比如，在一种实施方式中，所述组合物中可以包含整合有上述任一种融合基因的工程菌(特别是乳酸菌)或者包含分别整合有上述融合基因的工程菌(特别是乳酸菌)的组合，比如同时分别整合有如seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中所述的融合基因的乳酸菌的组合。

12、在本发明的第六方面，提供了一种活载体疫苗，其以乳酸菌为载体，并且包含上述第一方面中所述的任一种或多种融合基因或者包含上述第二方面中所述的任一种或多种表达载体。或者，所述活疫苗载体包含上述第三方面中所述的任一种或多种工程菌，所述工程菌以乳酸菌为出发菌株。在本发明的实施方式中，所述乳酸菌优选为植物乳杆菌，特别优选为丙氨酸消旋酶基因缺陷型植物乳杆菌nc8δalr。在本发明的一些实施方式中，所述融合

13、基因由编码佐剂ctb的基因分别与编码p49蛋白、编码p22蛋白、编码k205r蛋白、编码a137r蛋白和编码e248r蛋白的基因融合得到。在本发明的一些实施方式中，所述表达载体重组质粒，其包含上述第一方面中所述的任一种融合基因和psip409-pgsa’的载体，其中，所述重组质粒中的红霉素耐药基因erml被替换为asd-alr。在本发明的一些优选的实施方式中，所述活载体疫苗包含至少一种重组植物乳杆菌，优选为包含多种重组植物乳杆菌的组合，比如，所述活载体疫苗中包含的重组植物乳杆菌中整合有如seq id no:8、seq idno:9、seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中所述的任一种融合基因，或者是包含整合有上述任一种融合基因的重组植物乳杆菌的组合，特别是包含分别整合有如seq idno:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12中所述的融合基因的重组植物乳杆菌的组合。在本发明的一些实施方式中，所述活载体疫苗口服给药。所述施用对象为动物，特别为猪。

14、在本发明的第七方面，提供了一种获取上述第四方面中所述的asfv抗原融合蛋白的方法，其包括：构建上述第一方面中所述的融合基因；将所述融合基因插入表达载体中，形成重组表达载体；所述重组表达载体比如可以如上述第二方面中所述；将所述重组表达载体转化到宿主细胞中，所述宿主细胞选自乳酸菌、大肠杆菌或其他适合蛋白表达的微生物细胞；培养转化后的宿主细胞，以促进所述融合基因的表达，并产生所述asfv抗原融合蛋白。此外，所述方法还可以进一步包括：从培养的宿主细胞中收集所述asfv抗原融合蛋白，并分离和纯化所述asfv抗原融合蛋白的步骤。在本发明的一些实施方式中，可以通过利用比如his-tag进行亲和层析纯化，获得纯化的asfv抗原融合蛋白。

15、在本发明的第八方面，提供了上述第一方面中所述的融合基因或上述第二方面所述的重组表达载体或上述第三方面所述的工程菌或上述第四方面所述的非洲猪瘟病毒抗原融合蛋白或上述第五方面所述的药物组合物或药物制剂或饲料或上述第六方面所述的活载体疫苗在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的生物制剂或药物或饲料中的应用。所述生物制剂为疫苗，特别是活载体疫苗。

16、在本发明的第九方面，提供了一种防治非洲猪瘟的方法，包括向非洲猪瘟易感动物(特别是猪)施用有效剂量的上述第三方面中所述的工程菌或上述第六方面所述的活载体疫苗。所述有效剂量足以诱导受试者产生免疫应答，从而预防和/或治疗非洲猪瘟。该方法可通过注射、口服或其他适宜的给药途径实施。具体的剂量和施用频率根据受试者的健康状况、年龄、体重和疾病严重程度由兽医或专业人士确定。

17、相较于现有技术，本发明的优势包括：本发明构建一种融合基因，选择了与asfv感染密切相关的五种抗原蛋白(分别为p49、p22、k205r、a137r和e248r)，将其编码基因与霍乱毒素b亚基(ctb)融合，利用特定的乳酸菌表达载体psip409-pgsa’，构建了多株重组植物乳杆菌，这些重组植物乳杆菌能够表达产生可锚定在菌株表面的特定asfv融合抗原。这些重组植物乳杆菌可制备成活载体疫苗，通过口服等方式免疫动物，不仅能够有效地诱导并增强宿主的免疫反应，还具有良好的生物安全性、环境友好性，并且通过黏膜免疫、细胞免疫以及体液免疫提供对asfv的有效预防。此外，这些重组的乳酸菌诱导的应答偏向th1型，特别是复合菌株诱导th1型免疫反应的能力更强。th1可以分泌多种免疫细胞因子如干扰素，可以促进ctl(细胞毒性t淋巴细胞)反应，从而能够杀伤病毒，这表明说明表达asfv抗原的重组植物乳杆菌有杀伤asfv的潜力。

18、具体地，本发明通过在这些重组植物乳杆菌表面展示asfv抗原，能够直接向宿主的免疫系统递送抗原，特别是利用ctb作为佐剂，增强了宿主对这些抗原的免疫反应。这种方法可以在黏膜层面诱导免疫应答，对于通过黏膜途径感染的病原体尤其有效。本发明的重组植物乳杆菌采用非抗生素抗性标记进行选择，如asd-alr融合基因，减少了环境中抗生素抗性基因传播的风险，同时增强了生物安全性。本发明的重组植物乳杆菌作为黏膜递送载体，能够有效地将抗原传递到黏膜免疫系统，促进黏膜免疫应答的产生，这对于预防通过呼吸道和消化道传播的病原体尤为重要。本发明的重组植物乳杆菌可以促进宿主体内细胞免疫和体液免疫的双向反应，增加特异性抗体的产生，如iga和igg，从而增强对病原体的全面防御能力。此外，本发明所述的表达不同asfv抗原的重组植物乳杆菌之间的复合使用可产生联合免疫效果，可以显著诱导宿主的免疫应答，多菌株策略比单一菌株具有更好的免疫保护效果。以及，本发明的融合基因可通过加入his-tag，简化融合蛋白的后期纯化和检测过程，可以为疫苗的生产和质量控制提供了便利。