一种抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，ped）是一种由猪流行性腹泻病毒（ped virus，pedv）感染引起的一种急性、高度接触性的猪肠道传染性疾病，主要破坏猪空肠和回肠上皮细胞和肠绒毛，损伤猪的肠道黏膜。临床症状上，pedv 与 tgev、pdcov 高度类似，以水样腹泻、脱水和呕吐为基本特征，表现为呕吐、腹泻、全身性脱水等症状，各个年龄段的猪均对 pedv 易感，可使肥育猪体重下降，对哺乳仔猪危害最大，1 周龄以内仔猪死亡率高达 100%。ped 自上世纪 70 年代发现至今，严重影响了世界养猪业的健康发展，是养猪场重点防范的病毒性疫病之一，自 2010 年以来，本病在我国许多猪场相继出现和爆发，在 2011-2017 年期间，pedv 的阳性率很高，除此之外，国内省与省之间，国外洲与洲之间都存在有互相传播的报道，增加了仔猪的死亡率，造成了养殖业的损失。

2、因 pedv 感染机制复杂，影响了对 ped 的有效防控，另外，pedv 毒株变异和免疫失败致其感染率居高不下，尤其在新的变异流行毒株的出现后，对疾病的预防和控制迫在眉睫。目前，仍然没有防治 ped 的有效药物，预防 ped 发生的最主要方法疫苗接种。母猪肌注 pedv 弱毒疫苗和灭活疫苗所诱导的免疫应答是相似的，主要是使乳汁和血清中产生igg 抗体，由于母猪胎盘的不可通透性，仔猪天生无免疫球蛋白，而这种免疫并不会使机体产生黏膜免疫，导致养殖场新生仔猪还会大概率感染 pedv。猪传染性胃肠炎（tge），大肠杆菌病等发病时与 ped 非常相似，一周龄内哺乳仔猪或断奶仔猪均可表现为呕吐、腹泻等症状，因此单用临床诊断可能无法准确判断，通常与实验室诊断方法相结合。酶联免疫吸附试验（elasa）、免疫荧光检测、免疫层析等是常用的pedv血清学检测方法。

3、中和抗体是病原微生物入侵机体时产生的相应抗体，对清除病毒和疾病预防具有重要意义，中和抗体的产生是机体清除病原至关重要的一步。单克隆抗体也是病毒血清学检测方法建立的基础。目前对于pedv单克隆抗体的研究较多，如发明专利“cn110564696a一种具有pedv中和活性的单克隆抗体”、“cn112680421a 具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用”、“cn115261331a 一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体及其应用”以及“cn115386555a 一种杂交瘤细胞及其分泌的抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体”。尽管多年来大量科技人员对于pedv进行了大量深入的研究，采取了多种防控措施，但尚无有效手段彻底根除或防治该病。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体具有广谱中和活性，特异性强，灵敏度高，可以用于pedv药物的开发和pedv检测方法的建立。

2、为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5，包括重链和轻链，其特征在于：

4、所述重链的氨基酸序列如seq id no：3所示；

5、所述轻链的氨基酸序列如seq id no：4所示。

6、编码所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5的dna，包括重链的编码dna和轻链的编码dna，其特征在于：

7、所述重链的编码dna序列如seq id no：1所示；

8、所述轻链的编码dna序列如seq id no：2所示。

9、本发明还请求保护所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5在制备用于预防pedv感染的药物中的应用。

10、本发明还请求保护所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5在制备用于治疗pedv感染的药物中的应用。

11、本发明还请求保护所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

12、步骤一，杂交瘤细胞株2d5的培养；

13、步骤二，制备腹水：选取12～16周龄健康雄性balb/c小鼠，按0.5ml/只腹腔注射弗氏不完全佐剂，7～10日后每只小鼠腹腔接种l×106～5×106个2d5杂交瘤细胞，经7～10日后可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水，采集的腹水以8000r/min离心10min，弃去上层脂肪层，收集中层腹水，-70℃以下冻存备用；

14、步骤三，单克隆抗体的纯化：采用hitrap® protein g hp亲和层析柱配合蛋白液相层析系统，对制备的含有单克隆抗体的腹水进行纯化，纯化后的单克隆抗体无菌定量分装，1.0ml/管，-70℃以下保存备用。

15、所述杂交瘤细胞株2d5是以pedv-kb2013-4株病毒为抗原免疫小鼠后，经细胞融合后建立的杂交瘤细胞系。

16、基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

17、本发明以pedv-kb2013-4株病毒为免疫原，免疫小鼠后经细胞融合获得了多株杂交瘤细胞，其中杂交瘤细胞株2d5能够高效分泌单克隆抗体，且pedv-mabs-2d5具有相对较高的亲和力和中和活性，经动物实验表明，该单克隆抗体pedv-mabs-2d5对于pedv感染具有很好的预防和治疗作用，能够缩短动物排毒的时间，提高动物的存活性，减少或减轻腹泻、呕吐等pedv感染的症状，降低动物死亡率，该单克隆抗体具有制备用于预防或治疗pedv感染的药物的潜力。

技术特征：

1.一种针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5，包括重链和轻链，其特征在于：

2.编码权利要求1所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5的dna，包括重链的编码dna和轻链的编码dna，其特征在于：

3.根据权利要求1所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5在制备用于预防pedv感染的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5在制备用于治疗pedv感染的药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的针对pedv的单克隆抗体pedv-mabs-2d5的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞株2d5是以pedv-kb2013-4株病毒为抗原免疫小鼠后，经细胞融合后建立的杂交瘤细胞系。

技术总结本发明以PEDV‑KB2013‑4株病毒为免疫原，免疫小鼠后经细胞融合获得了多株杂交瘤细胞，其中杂交瘤细胞株2D5能够高效分泌单克隆抗体，且PEDV‑Mabs‑2D5具有相对较高的亲和力和中和活性，经动物实验表明，该单克隆抗体PEDV‑Mabs‑2D5对于PEDV感染具有很好的预防和治疗作用，能够缩短动物排毒的时间，提高动物的存活性，减少或减轻腹泻、呕吐等PEDV感染的症状，降低动物死亡率，该单克隆抗体具有制备用于预防或治疗PEDV感染的药物的潜力。技术研发人员：张磊,冯平,陈瑞受保护的技术使用者：诺威利华（广东）生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18