一种与棉花纤维品质性状相关的类DCN1蛋白基因GoDCN1L分子标记及其应用

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种与棉花纤维品质性状相关的类dcn1蛋白基因godcn1l的分子标记及其应用。

背景技术：

1、棉花(gossypium spp.)是重要的经济作物之一，是关系到我国国计民生的重要战略物资和纺织工业原材料。陆地棉和海岛棉是两个主要的异源四倍体栽培棉种，二者源于共同祖先但独立驯化而成。陆地棉又称细绒棉，纤维品质中等，适应性强，产量高，占世界棉花总产量的90％；海岛棉又称长绒棉，具有优异的纤维品质和高抗黄萎病特性但产量低。挖掘海岛棉中优异的纤维品质相关qtl/基因，通过杂交及回交转育等手段将其导入现有陆地棉品种中，是陆地棉品质改良的一个有效方法(苏威，2017)。迄今为止，通过精细定位获得候选基因的纤维品质相关qtls较少，而对获得的目的基因进行机理解析及利用的研究更鲜有报道。

2、染色体片段渐渗系(chromosome segment substitution lines，cssls)是通过连续的回交和自交，构建的能够覆盖供体植物整个基因组的一系列近等基因系。它的遗传背景与轮回亲本相同，基因组内只含有供体亲本的一个或多个纯合的染色体片段。染色体片段渐渗系群体属于永久性分离群体，可以在多个环境下进行qtl分析，并且不受遗传背景的干扰，是进行qtl初步鉴定和检测稳定qtl的优良材料。近年来，随着测序技术的快速发展，在棉花中利用渐渗系群体，开展目标性状相关qtl鉴定及候选基因挖掘的文章被陆续报道。ma等(2019)利用陆地棉cri36和海岛棉h7124构建了bil群体，基于高密度遗传图谱，检测到10个与株高相关的qtl，贡献率为4.27-14.92％，其中4个为稳定qtl，基于功能注释和转录组数据分析，发现编码生长素载体蛋白的gh_d01g1471是可能的候选基因，命名为ghpin3。liú等(2023)利用231个陆地棉重组自交系(ril)群体，基于高密度遗传图谱，检测到295个纤维品质和产量性状的qtls，其中139个稳定qtls，包括75个纤维品质性状qtls，64个产量性状qtls，其中新鉴定的qtls35个；通过wgcna鉴定出11个候选基因，并确定了gh_d07g2262(ghcesa4)正调控纤维长度和纤维强度形成，负调控衣分。因此，染色体片段渐渗系是挖掘优异的qtl和候选基因的有效方法，大大加快了育种效率。

3、植物激素在植物生长发育中发挥着不可或缺的作用，生长素是最早发现的植物激素之一，也是研究最广泛的植物激素之一。棉纤维的发育是一个非常复杂的生物学过程，涉及大量内源物质的代谢和多种内源激素的调节。生长素在纤维细胞中特异积累决定纤维细胞的数量，与其他激素共同参与调控棉纤维的发育，通过对生长素合成基因及信号转导基因的时空精准调控，可实现棉花纤维产量和品质的同步改良(zhang et al.2011；zhang etal.2017；zhu et al.2022；xi et al.2023)。dcn1和dcn1类蛋白具有一个cullin类泛素化的结构域，该dcn家族的蛋白可帮助scftir1型e3泛素连接酶复合物cullin组分的类泛素化修饰，进而降解下游aux/iaa，抑制转录因子复合体释放生长素响应因子arf，参与生长素信号转导，说明类dcn1蛋白可能在棉纤维发育及纤维品质性状形成中发挥作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种与棉花纤维品质性状相关的类dcn1蛋白基因godcn1l分子标记及其应用。

2、本发明的目的可通过如下技术方案实现：

3、第一方面，本发明请求保护与棉花纤维品质性状相关的indel分子标记或检测所述indel分子标记的物质的应用，该indel分子标记是核苷酸序列如seq id no.4所示棉花类dcn1蛋白基因godcn1l中基因组序列第1465bp存在的一个11bp的核苷酸片段(tttttctgtag)插入；

4、所述的应用为下述(a1)-(a5)中的至少一种应用：

5、(a1)筛选或辅助筛选高纤维品质性状的棉花种质，或者制备筛选或辅助筛选高纤维品质性状棉花种质的产品；

6、(a2)鉴定或辅助鉴定棉花纤维品质性状，或者制备鉴定或辅助鉴定棉花纤维品质性状的产品；

7、(a3)鉴定棉花类dcn1蛋白基因godcn1l的单倍型，或者制备鉴定棉花类dcn1蛋白基因godcn1l单倍型的产品；

8、(a4)改良棉花纤维品质性状，或者制备用于改良棉花纤维品质性状的产品；

9、(a5)棉花育种，或者制备棉花育种产品。

10、进一步，所述的棉花类dcn1蛋白基因godcn1l存在两种单倍型，单倍型1的基因组核苷酸序列如seq id no.1所示，单倍型2的基因组核苷酸序列如seq id no.4所示，单倍型2较单倍型1在第四个外显子区有一个11bp的核苷酸片段插入，导致翻译提前终止；单倍型1的纤维品质性状高于单倍型2。

11、第二方面，本发明请求保护一种产品，该产品中含有检测indel分子标记的物质，且为下述(b1)-(b5)中的至少一种：

12、(b1)筛选或辅助筛选不同纤维品质性状棉花种质的产品；

13、(b2)鉴定或辅助鉴定棉花纤维品质性状的产品；

14、(b3)鉴定棉花类dcn1蛋白基因godcn1l单倍型的产品；

15、(b4)用于改良棉花纤维品质性状的产品；

16、(b5)用于棉花育种产品。

17、第三方面，本发明请求保护一种方法，该方法为下述(c1)-(c5)中的至少一种方法：

18、(c1)筛选或辅助筛选高纤维品质性状棉花种质的方法；

19、(c2)鉴定或辅助鉴定棉花纤维品质性状的方法；

20、(c3)鉴定棉花类dcn1蛋白基因godcn1l单倍型的方法；

21、(c4)改良棉花纤维品质性状的方法；

22、(c5)棉花育种方法；

23、该方法为采用检测indel分子标记的物质检测待测棉花种质材料的类dcn1蛋白基因godcn1l中是否含有所述的indel分子标记，以此鉴定棉花类dcn1蛋白基因godcn1l的单倍型；所述的棉花类dcn1蛋白基因godcn1l存在两种单倍型，单倍型2较单倍型1在第四个外显子区有一个11bp的核苷酸片段插入；单倍型1的纤维品质性状高于单倍型2；选择携带类dcn1蛋白基因godcn1l单倍型1的待测棉花种质材料作为高纤维品质性状的棉花种质，用于棉花育种，改良棉花纤维品质性状。

24、本发明的技术方案中，所述的检测所述indel分子标记的物质为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：

25、(d1)含有特异性扩增所述indel分子标记的如seq id no.5和seq id no.6所示的体外核酸扩增引物；

26、(d2)含有(d1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；

27、(d3)含有(d1)所述体外核酸扩增引物或(d2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；

28、(d4)含有(d1)所述体外核酸扩增引物、(d2)所述体外核酸扩增试剂或(d3)所述试剂盒的检测仪器。

29、本发明的技术方案中，所述的棉花纤维品质性状为纤维长度、纤维强度、纤维细度和纤维整齐度中的至少一种。

30、第四方面，本发明请求保护核苷酸序列如seq id no.1所示的类dcn1蛋白基因godcn1l促进所述类dcn1蛋白基因godcn1l表达的物质或提高所述类dcn1蛋白基因godcn1l编码蛋白的活性或含量的物质在如下el)或e2)中的应用：

31、el)改良棉花纤维品质性状或培育棉花纤维品质性状改良的新种质；

32、e2)促进目标植物生长。

33、本发明研究表明，在拟南芥中过表达所述类dcn1蛋白基因godcn1l的单倍型1，相比于野生型(wt)，过表达拟南芥株系根长更长，茎毛更多，株高更高，果荚更长，能促进拟南芥的生长。

34、进一步，上述的促进所述类dcn1蛋白基因godcn1l表达的物质或提高所述类dcn1蛋白基因godcn1l编码蛋白活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述fl)～f6)任一种:

35、f1)含有所述类dcn1蛋白基因godcn1l的表达盒；

36、f2)含有所述类dcn1蛋白基因godcn1l的重组载体、或含有f1)所述表达盒的重组载体；

37、f3)含有所述类dcn1蛋白基因godcn1l的重组微生物、或含有f1)所述表达盒的重组微生物、或含有f2)所述重组载体的重组微生物；

38、f4)含有所述类dcn1蛋白基因godcn1l的转基因植物细胞系、或含有f1)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有f2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

39、f5)含有所述类dcn1蛋白基因godcn1l的转基因植物组织、或含有f1)所述表达盒的转基因植物组织、或含有f2)所述重组载体的转基因植物组织；

40、f6)含有所述类dcn1蛋白基因godcn1l的转基因植物器官、或含有f1)所述表达盒的转基因植物器官、或含有f2)所述重组载体的转基因植物器官。

41、更进一步，所述类dcn1蛋白基因godcn1l编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

42、第五方面，本发明请求保护一种提高棉花纤维品质性状或促进目标植物生长的方法，以类dcn1蛋白基因godcn1l为靶基因，通过基因工程方法，在棉花或目标植物中过表达核苷酸序列如seq id no.1所示的类dcn1蛋白基因godcn1l，提高棉花纤维品质性状或培育棉花纤维品质性状提高的棉花新种质或促进目标植物生长。

43、本发明利用一个优质纤维的海陆渐渗系材料l240与受体亲本tm-1杂交构建次级分离群体，结合l240的重测序数据，获得精准渐渗区段，对渐渗片段上的插入/缺失位点开发indel标记，结合次级群体的纤维品质表型值与基因型进行连锁分析，鉴定到一个稳定的纤维整齐度qtl(qfu-chr.d04)，进一步利用候选区段内重组体进行置换作图，获得qtl的候选区间。结合候选区间内基因在l240和tm-1不同纤维发育时期的差异表达情况，发现了一个参与调节cullin泛素化修饰的类dcn1蛋白基因godcn1l，id号gb_d04g0497。该基因在l240不同纤维发育时期中均表达，在tm-1中基本不表达。基因组结构分析显示该基因在tm-1中的第四个外显子区有一个11bp的插入，导致提前终止。类dcn1蛋白基因godcn1l在两亲本l240和tm-1中的序列分别命名为单倍型1和单倍型2，亲本之间单倍型1较单倍型2在纤维长度、纤维强度、纤维细度和纤维整齐度方面存在优势。针对godcn1l两个单倍型间11bp的插入/缺失位点，开发indel功能分子标记，并在海岛棉自然群体中利用该indel位点完成基因分型，结合纤维品质表型数据进行关联分析，发现单倍型1较单倍型2在纤维长度、纤维强度、纤维细度和纤维整齐度方面也存在优势。单倍型1较单倍型2对提高纤维品质性状方面存在显著优势，异源表达单倍型1的拟南芥植株根长及生长势均优于对照植株，godcn1l在促进棉纤维发育及纤维品质性状形成中发挥作用。

44、利用本发明筛选到的一个功能分子标记，采用功能分子标记专用引物检测类dcn1蛋白基因godcn1l不同单倍型间的差异位点。选择携带类dcn1蛋白基因godcn1l单倍型1的待测样品即为具有高纤维品质性状的棉花种质。所述的功能分子标记专用引物的正反向引物序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。所述的检测包括在基因水平或/和蛋白水平进行检测。研究表明，当单倍型1基因序列或其编码的蛋白质存在于棉花植株中时，所述等位基因或其蛋白质可促进棉花纤维长度、纤维比强度、纤维整齐度增加和马克隆值降低，说明该基因单倍型1在改良棉花纤维品质性状以及培育棉花优质新品种中具有重要作用和应用前景。

45、本发明技术方案的开发过程具体包括以下步骤：

46、1.对一个优质纤维的海陆渐渗系材料l240与tm-1杂交构建(l240×tm-1)f2/f2:3次级分离群体。调查次级分离群体的纤维品质性状(纤维长度，纤维强度，马克隆值，纤维整齐度和纤维伸长率)，获得表型数据。

47、2.结合l240的全基因组重测序信息，对渐渗片段上的插入/缺失位点，开发indel标记，筛选多态性indel引物。利用多态性indel引物，对次级分离群体单株进行基因型鉴定，获得基因分型数据。

48、3.利用f2单株和f2:3株系的纤维品质检测数据与f2单株的indel标记基因型数据进行qtl作图，检测到一个稳定的纤维整齐度相关qtl(qfu-chr.d04)，结合置换作图，明确了该qtl的候选区间。

49、4.结合候选区间内基因在亲本间不同纤维发育时期的表达情况，得到一个类dcn1蛋白基因godcn1l为该纤维整齐度相关qtl的候选基因。该基因在l240不同纤维发育时期中均表达，在tm-1中基本不表达。序列结构分析表明该基因在tm-1中的第四个外显子区有一个11bp的插入，导致翻译提前终止。godcn1l在两亲本l240和tm-1中的序列分别命名为单倍型1和单倍型2。单倍型1的基因组序列为seq id no.1，cds序列为seq id no.2，其编码的氨基酸序列为seq id no.3。单倍型2的基因组序列为seq id no.4，单倍型2较单倍型1在第四个外显子区有一个11bp的核苷酸插入，导致翻译提前终止。

50、5.在godcn1l两个单倍型间11bp的插入/缺失位点，开发indel功能分子标记。利用海岛棉自然群体对该indel位点进行基因分型，结合纤维品质表型数据进行关联分析，发现单倍型1较单倍型2在纤维长度、纤维强度、纤维细度和纤维整齐度方面也存在优势。

51、6.本发明还构建了单倍型1的过表达拟南芥转基因株系。与野生型wt相比，异源过表达棉花godcn1l基因的拟南芥株系，其根长明显更长，茎毛更多，株高更高，果荚更长。说明过表达godcn1l单倍型1显著促进拟南芥植株根伸长和生长势增强。

52、本发明的优点表现在：

53、1.本发明利用连锁分析和置换作图，在一个优质纤维的海陆渐渗系材料中，鉴定了一个稳定的棉纤维整齐度qtl(qfu-chr.d04)，结合候选区间内基因在两亲本l240和tm-1间不同纤维发育时期的表达情况，克隆了一个类dcn1蛋白基因godcn1l，为该qtl的候选基因。

54、2.根据godcn1l的不同基因型可以将重组体群体分为两类，即单倍型1(g1-g6)和单倍型2(g7-g9)。通过统计学分析发现，不同单倍型对应的单株间纤维整齐度存在显著差异。

55、3.godcn1l在两亲本间不同纤维发育时期的表达水平通过转录组数据获得，由定量数据验证。该基因在l240不同纤维发育时期中均表达，在tm-1中基本不表达。在l240的5-10天纤维中godcn1l表达量高于15-20天的纤维，表明该基因在纤维伸长期发挥重要作用。

56、4.在godcn1l两个单倍型间11bp的插入/缺失位点，开发了一个indel功能分子标记，用于区分类dcn1蛋白基因godcn1l的两个单倍型。可作为分子标记辅助筛选或鉴定样品中是否包含上述类dcn1蛋白基因godcn1l的单倍型1。

57、5.亲本之间单倍型1较单倍型2在纤维长度、纤维强度、纤维细度和纤维整齐度方面存在优势；在海岛棉自然群体中，单倍型1较单倍型2在纤维长度、纤维强度、纤维细度和纤维整齐度方面也存在优势。表明单倍型1较单倍型2对提高纤维品质性状方面存在显著优势，可用于改良棉花纤维品质性状以及培育棉花优质新品种。

58、6.相比于野生型(wt)，godcn1l基因单倍型1过量表达拟南芥株系，其根长明显更长，茎毛更多，株高更高，果荚更长。