嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系及其构建方法

本发明涉及细菌遗传转化体系及其构建方法，尤其涉及嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系及其构建方法。

背景技术：

1、根癌农杆菌(a.tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细菌，感染后会在植物中诱导肿瘤。它自然携带含有转移dna(t-dna)的质粒，两侧是两个称为左右边界的定向序列重复序列(escobar和dandekar，2003)。这种微生物已被广泛研究为将外源基因引入植物的生物技术工具，但也可用于真菌。与pmt或电穿孔相比，根瘤农杆菌介导法(atmt)导致单拷贝整合，其中经常观察到多拷贝整合。

2、遗传和代谢工程策略已经提高了产量，并提高了真菌中自然产生的各种有价值的分子，以及异源产生的分子。然而，野生型菌株通常不会以工业要求的水平产生这些化合物，或者不能产生具有所需特性或催化特异性的所需酶。为了克服这些问题，已经开发了不同的基因工程方法来提高真菌的工业潜力。酚类乙酰丁香酮在增加毒力基因活性方面具有重要作用，这反过来又会触发感染并将t-dna转移到宿主细胞中(utami etal.，2018)。在松露t.borchii中，在补充有200μm乙酰丁香酮的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上预生长菌丝体也导致更高的转化频率(grimaldi etal.，2005；brenna etal.，2014)农杆菌细胞的过度生长在选择过程中会产生问题，因为它会干扰真菌的发育和生长，甚至可能导致菌丝体死亡。大多数报告的研究在选择培养基中使用单一或多种抗生素来控制农杆菌的过度生长。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法。

2、具体地，嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，构建含嘴突凸脐蠕孢菌lac12基因的根癌农杆菌，与嘴突凸脐蠕孢菌共培养获得转化体，其中，所用的培养基中含有100-200μm乙酰丁香酮。

3、进一步地，嘴突凸脐蠕孢菌材料可以是菌丝、或孢子。其中，采用菌丝时，优选取距离生长原点1.5-3厘米处的菌丝体圆柱体。

4、进一步地，大肠杆菌与根癌农杆菌共培养的时间为3-5天，优选4-5天。

5、进一步地，共培养中，大肠杆菌与根癌农杆菌在硝酸纤维素膜上28℃下黑暗培养。

6、进一步地，本发明包括转化体的筛选，即将所得的转化体接种至含50mg/l卡那霉素的硝酸纤维素膜上进行黑暗培养，将存活或者抗性转化株亚培养，完成转化体的筛选。优选地，黑暗培养条件：28℃，培养2-6天，存活/抗性转化株亚培养2周。

7、嘴突凸脐蠕孢菌lac12的cdna序列如seq id no.1所示。

8、共培养使用im固体培养基，其配方如下：1.25m k磷酸盐缓冲液，ph4.8；100ml m-n缓冲液；100ml0.01％ feso4溶液；50ml 1％ cacl2溶液；100ml孢子元素；100ml 20％nh4no3；20％葡萄糖；1m mes(ph 5.5)；15g/l的琼脂粉；乙酰丁香酮(as)100μm-200μm；ph至5.5。

9、所述嘴突凸脐蠕孢菌为嘴突凸脐蠕孢菌y9511-x050。

10、本发明的目的之二是提供嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系。

11、所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系由上述嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法构建而得。

12、本发明的优点：

13、1.本发明优选了培养基中的乙酰丁香酮为100-200μm，提高转化率。

14、2.本发明优选了共培养时间为3-5天，进一步提高转化率。

15、3.本发明优选了根癌农杆菌菌丝体发育阶段，进一步提高转化率。

16、4.本发明优选了筛选转化体时使用的培养基中卡那霉素浓度，获取存活以及抗性转化株。

技术特征：

1.嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，构建含嘴突凸脐蠕孢菌lac12基因的根癌农杆菌，与嘴突凸脐蠕孢菌共培养获得转化体，其中，所用的培养基中含有100-200μm乙酰丁香酮。

2.根据权利要求1所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述嘴突凸脐蠕孢菌lac12的cdna序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述嘴突凸脐蠕孢菌的材料是菌丝、或孢子。

4.根据权利要求3所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述嘴突凸脐蠕孢菌的材料是菌丝时，取距离生长原点1.5-3厘米处的菌丝体圆柱体。

5.根据权利要求1所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述大肠杆菌与根癌农杆菌共培养的时间为3-5天。

6.根据权利要求1所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述嘴突凸脐蠕孢菌与根癌农杆菌共培养的时间为4-5天。

7.根据权利要求1所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，包括转化体的筛选，将所得的转化体接种至含50mg/l卡那霉素的硝酸纤维素膜上进行黑暗培养，将存活或者抗性转化株亚培养，完成转化体的筛选。

8.根据权利要求1-7任一项所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述共培养使用im固体培养基，其配方如下：1.25m k磷酸盐缓冲液，ph4.8；100ml m-n缓冲液；100ml 0.01％feso4溶液；50ml 1％cacl2溶液；100ml孢子元素；100ml 20％nh4no3；20％葡萄糖；1m mes，ph 5.5；15g/l的琼脂粉；乙酰丁香酮100μm-200μm；ph至5.5。

9.据权利要求1-8任一项所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，其特征是，所述嘴突凸脐蠕孢菌为嘴突凸脐蠕孢菌y9511-x050。

10.嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系，由权利要求1-9任一项所述的嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法而得。

技术总结本发明公开了嘴突凸脐蠕孢菌遗传转化体系的构建方法，构建含嘴突凸脐蠕孢菌LAC12基因的根癌农杆菌，与嘴突凸脐蠕孢菌共培养获得转化体，其中，所用的培养基中含有100‑200μM乙酰丁香酮。本发明优选了培养基中的乙酰丁香酮为100‑200μM，提高转化率。技术研发人员：安静,陈勇,古尔夫拉兹·阿什里特,李明蔚,袁玉泉,董朝霞受保护的技术使用者：华南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20