检测假结核耶尔森氏菌的RPA引物对、RPA-LFS引物组及试剂盒

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种假结核耶尔森氏菌的rpa引物对、rpa-lfs引物组及试剂盒。

背景技术：

1、假结核耶尔森氏菌是肠杆菌科、耶尔森氏菌属的一种，是革兰氏阴性菌，在0～45℃均可生长，但22～30℃最佳，低温可存活6个月以上。它是一种重要的人兽共患致病菌，具有广泛的宿主范围，能够感染包括人类在内的多种动物。感染人类引起疾病，如肠炎、反应性关节炎、肠系膜淋巴结炎、结节性红斑和败血症等，也能在很多动物身上分离到，如猴子、猪、狗、兔子、鹿等，对这些动物的危害有时候是致命的。假结核耶尔森氏菌可以在食品的冷藏环境下复制，是一种重要的食源性病原体，因此，建立一种简单、快速、准确检测假结核耶尔森氏菌的方法具有重要意义。

2、目前，现有的检测假结核耶尔森氏菌的方法主要有传统培养法、免疫诊断和核酸诊断。传统培养法是将样本放在合适的条件下增菌和分离培养，然后进行一系列生化鉴定，对结果进行综合评估，判定是否为假结核耶尔森氏菌。传统培养法工作量大，检测周期长，需要专业的技术人员，只能在实验室内进行，无法进行现场检测。免疫诊断是利用抗原抗体的特异性结合进行检测，tomasz wielkoszynski建立了一种eilsa方法，以全菌为基础，以重组myfa和psaa为抗原，可以检测耶尔森氏菌病。免疫诊断方法特异性强，但操作复杂，检测时间长，需要专业的技术人员。核酸诊断技术因其特异性强，灵敏度高而受到人们的高度关注。利用核酸检测假结核耶尔森氏菌的方法目前主要是pcr技术和lamp环介导等温扩增技术。pcr技术被广泛用于病原体的检测，但是由于其需要经过变性、复性、延伸不同步骤，需要多个温度阶段，对实验设备要求高，局限于实验室内的研究，不适宜于现场检测。与pcr技术相比，lamp环介导等温扩增技术不需要复杂的温度变换，更加简单、快速，且特异性和灵敏度与pcr相当，降低了检测成本，适宜于现场快速检测。lamp技术需要多个引物，引物设计复杂，且不适宜多重扩增。所以，寻找一种新的适宜于现场检测检测假结核耶尔森氏菌的方法具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种假结核耶尔森氏菌的rpa引物对、rpa-lfs引物组及试剂盒，可以快速检测假结核耶尔森氏菌，且特异性和灵敏度高。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种基于rpa检测假结核耶尔森氏菌的引物对，包括序列如seq id no:1所示的上游引物rpa-f和序列如seq id no:2所示的下游引物rpa-r。

4、第二方面，本发明提供了一种基于rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的引物组，包括序列如seq id no:1所示的上游引物rpa-f、序列如seq id no:2所示的下游引物rpa-r和序列如seq id no:3所示的探针rpa-p；

5、所述下游引物rpa-r的5’端添加生物素标记；

6、所述探针rpa-p中的第31位碱基g被[thf]替换。

7、按上述方案，所述探针rpa-p的5’端添加荧光基团fam或fitc，3’端引入c3-spacer进行末端封闭。

8、第三方面，本发明提供了一种利用rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的试剂盒，包括上述基于rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的引物组。

9、优选的，所述试剂盒还包括反应缓冲液和侧流层析试纸条。

10、优选的，所述试剂盒还根据需要包括阴性对照和/或阳性对照。

11、第四方面，本发明还提供了一种基于rpa-lfs对假结核耶尔森氏菌进行快速检测的方法，包括如下步骤：

12、提取待测样品的基因组dna；

13、利用上述基于rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的引物组或上述试剂盒对基因组dna进行rpa-lfs反应，并进行结果判定。

14、按上述方案，所述rpa-lfs反应的温度为30～35℃，优选为35～45℃，反应的时间为10～30min。

15、按上述方案，所述假结核耶尔森氏菌的最低检测限为206cfu/ml。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明提供的基于rpa检测假结核耶尔森氏菌的引物对和基于rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的引物组无假阳性，扩增效果好且具有高度特异性。

18、采用基于本发明引物组的rpa-lfs可以对假结核耶尔森氏菌进行现场快速可视化检测，操作简单，不需要复杂的温控设备，克服了对实验室设备的依赖性，可以在设备条件不充足的地区进行现场检测，省去了样品运输的时间，同时避免了运输对检测结果的影响，且直接通过试纸条快速读取结果；

19、使用本发明的引物对以及方法对假结核耶尔森氏菌进行检测，特异性强，与其他肠杆菌科致病菌和食品安全致病菌无交叉反应，灵敏度高，检测时间短，对高浓度模板可以在10min内完成检测，对于低浓度模板可以在25～30min内完成检测，且最低检测限低，在模板浓度为206cfu/ml时，检出阳性概率为95％。

技术特征：

1.一种基于rpa检测假结核耶尔森氏菌的引物对，其特征在于，包括序列如seq id no:1所示的上游引物rpa-f和序列如seq id no:2所示的下游引物rpa-r。

2.一种基于rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的引物组，其特征在于，包括序列如seq idno:1所示的上游引物rpa-f、序列如seq id no:2所示的下游引物rpa-r和序列如seq idno:3所示的探针rpa-p；

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述探针rpa-p的5’端添加荧光基团fam或fitc，3’端引入c3-spacer进行末端封闭。

4.一种利用rpa-lfs检测假结核耶尔森氏菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应缓冲液和侧流层析试纸条。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照。

7.一种基于rpa-lfs对假结核耶尔森氏菌进行非疾病诊断目的快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述rpa-lfs反应的温度为30～45℃，反应的时间为10～30min。

9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述假结核耶尔森氏菌的最低检测限为206cfu/ml。

技术总结本发明属于微生物检测技术领域，公开了一种检测假结核耶尔森氏菌的RPA引物对、RPA‑LFS引物组及试剂盒。基于RPA检测假结核耶尔森氏菌的引物对包括序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物RPA‑F和序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物RPA‑R，基于RPA‑LFS检测假结核耶尔森氏菌的引物组包括上游引物RPA‑F、下游引物RPA‑R和序列如SEQ ID NO:3所示的探针RPA‑P，下游引物RPA‑R的5’端添加生物素标记，探针RPA‑P中的第31位碱基G被[THF]替换。该引物组和引物对可以快速检测假结核耶尔森氏菌，且特异性和灵敏度高，最低检测限低。技术研发人员：王深琪,张雪花,陈威,涂思,周波受保护的技术使用者：华中科技大学技术研发日：技术公布日：2024/8/20