一种检测人类红细胞ABO基因分型并区分A201亚型、A205亚型、O3亚型的引物组、试剂盒及其用途的制作方法

本发明涉及基因检测试剂盒领域，具体涉及一种检测人类红细胞abo基因分型并区分a201亚型、a205亚型、o3亚型的引物组、试剂盒及其用途。

背景技术：

1、abo基因座位于人类第9号染色体（9q34），且a、b、o基因高度同源，有7个外显子。abo基因长度约1060bp，编码353个氨基酸。a基因和b基因编码糖基转移酶，而o基因为无效基因。b基因与a基因在cdna序列第297、703、796和803bp这4个碱基位点存差异；o基因与a基因的区别为cdna第261bp碱基g缺失。a型主要有a1与a2亚型，此外还有a3、am和ax等。与a1基因比较，a201基因在cdna第467bp存在a/t替换和第1061bp碱基c缺失。a型红细胞与抗-a和抗-a1试剂均反应的被定义为a1型，与抗-a试剂反应而不与抗-a1试剂反应的被定义为a2亚型。因现行的常规血清学正定型时不加抗-a1，所以a2检测正反定型格局与a1相同，大部分a2漏检。部分a2亚型个体携带抗-a1，使a2亚型血清学反应格局反定型出现与a1细胞凝集，正反定型不一致，可以血清学常规检测到。中国人群常见的a2亚型是a205型、a201型。a2亚型表型与a2亚型基因型两者之间并非完全对应：即血清学反应格局的a2表型对应的基因型有部分是已知的非a2亚型基因型。a2基因型鉴定有助于解释abo同表型输血产生不良反应的原因，也有助于解决abo基因错配造血干细胞一致有效输血的问题。经基因检验可以对血型进行确定，同型输血效果较为理想。a2基因型鉴定结果克服了血清学的方法学限制，可能揭示血清学无法解释的输血不良反应问题，可作为血清学的常规补充技术，有必要全面推广a2基因分型方法的临床应用。o3亚型是o基因的一个亚型，其分子生物学机制为：与o1相比，o3缺少g261的缺失，但有一个突变(g802a)，可通过改变其糖结合位点使酶失活。abo血型系统是保障输血安全最重要的血型系统，同样abo血型鉴定也是保证输血安全最关键的技术，正确的abo血型鉴定是安全输血的前体条件，输入abo血型不相合的血液，轻者可导致无效输血，重者危机患者生命。血清学技术鉴定abo血型系统只能鉴定表型，在鉴定异常表达的个体和作遗传分析时受到局限。abo血型基因分型技术在输血医学中可结合血清学诊断结果应用于临床，abo基因分型结果可作为遗传标记物应用于干细胞移植后嵌合体检测及亚型的家系研究。现有的abo基因检测试剂在遇到a2亚型时，会出现假阳性、假阴性、无法区分a2的纯合子和杂合子等问题，且无法辨别o3亚型，这是由引物设计、孔位设计、内参选择、反应条件选择等多方面原因造成的。

技术实现思路

1、本发明基于聚合酶链式反应-序列特异性引物法（pcr-ssp）反应原理，利用包被在96孔pcr板中的多组等位基因特异性引物，通过rt-pcr仪器特异性扩增abo等位基因。扩增反应液中所使用的不饱和荧光染料sybr greenⅰ荧光染料，只与双链dna（dsdna）结合后发光，未结合dsdna的荧光染料不发光，发光强度与扩增后的dsdna含量成正相关。荧光定量pcr仪在最大吸收波长约为497nm、最大发射波长约为520nm波长范围内收集荧光信号。当样本中的dna被扩增后，rt-pcr仪器收集的荧光信号将形成扩增曲线及特征性熔解曲线。在每个反应孔中均与特异性引物一同包被的内参引物对，用以检验反应体系扩增有效性，并每人份单独包被一孔设定为阴性对照孔。熔解曲线以荧光信号改变的负一次导数与温度作图，tm值为扩增产物解链50%的温度，在多产物的情况下只显示其中最高tm值的特征性熔解曲线峰。内参引物对扩增产物的特征性熔解曲线tm值均低于特异性扩增产物tm值，特异性引物阴性时均被检出，揭示孔内反应有效；特异性引物阳性时，只显示特异性扩增产物tm值。当除阴性对照孔无反应外，每个孔位都有一条符合质控要求的扩增曲线及特征性熔解曲线，则表示扩增有效，通过对特征性熔解曲线tm值定性判断孔位阴阳性，依据结果分型表所示阳性孔位组合，定性判读基因分型结果，基因分型结果需符合人类基因遗传规则。

2、本发明引物组的设计依据美国国家生物技术信息中心（ncbi）建立的dna序列数据库（genbank）中公开的人类基因序列，针对abo相关基因突变或缺失等信息设计特异引物；内参引物设计依据ncbi数据库公开的基因序列信息，根据人类基因的保守区域设计。引物组的序列如seq id no.1-22所示，其中：第一组引物对如序列seq id no.1-2所示，检测abo基因中a201基因的信息；第二组引物对如序列seq id no.3-4所示，检测abo基因中非a201的abo基因的信息；第三组引物对如序列seq id no.5-6所示，检测abo基因中a205基因的信息；第四组引物对如序列seq id no.7-8所示，检测abo基因中非a205的abo基因的信息；第五组引物对如序列seq id no.9-10所示，检测abo基因中o3基因的信息；第六组引物对如序列seq id no.11-12所示，检测abo基因中非o3的abo基因的信息；第七组引物对如序列seqid no.13-14所示，检测abo基因中b基因的信息；第八组引物对如序列seq id no.15-16所示，检测abo基因中非b的abo基因的信息；第九组引物对如序列seq id no.17-18所示，检测abo基因中o基因的信息；第十组引物对如序列seq id no.19-20所示，检测abo基因中非o的abo基因的信息。

3、每一组引物对分别处于不同的反应容器内。内参引物对的序列如seq id no.21-22所示，内参引物对既可以加入检测孔中，检测样本的信息，也可以作为阴性对照孔，对检测进行质量控制。

4、包括以上引物组的检测人类红细胞abo基因分型并区分a201亚型、a205亚型、o3亚型的试剂盒还包括由23%的10×pcr buffer、45%的gc buffer、18%的浓度为2.5mm的dntp、2%的浓度为5u/μl的dna聚合酶、1%的sybr greenⅰ荧光染料及11%的水等组分构成的浓缩反应液。该试剂盒的使用方法为如下顺序的步骤：

5、（1）从冷冻冰箱取出试剂盒中所需数量的试剂，室温解冻；

6、（2）观察pcr板包被的引物及浓缩反应液室温溶解后，其颜色为粉红或紫色方可使用，pcr板包被的引物均于板底存在，否则失效不能使用；

7、（3）在510μl浓缩反应液中加入650μl纯化水，制成反应液；

8、（4）每人份样本使用120μl反应液与12μl样本dna混合，制成工作反应液；

9、（5）撕掉pcr板上透明封板膜放置在水平桌面，向检测孔中加入10μl工作反应液，向阴性对照孔中加入10μl反应液，加样后用板式离心机瞬时离心或手工轻轻震荡使混合液滑至管底部；

10、（6）使用推荐封膜机及铝膜热封反应板顶部，反应孔应完全被封闭。封膜机推荐条件：175℃，4.5s；或滴管加入25±10μl石蜡油蜡封，然后将封板膜重新覆上引物板。封膜处可做样本顺序标记；

11、（7）将密封后的工作引物板放入荧光定量pcr仪中进行pcr扩增，在96℃进行2分钟的预变性，然后进行5个循环的96℃20秒和68℃60秒的反应，然后进行10个循环的96℃20秒、65℃50秒和72℃45秒的反应，然后进行15个循环的96℃20秒、62℃50秒和72℃45秒的反应，最后在72℃延伸2分钟；

12、（8）根据阳性判断值和结果分型表对实验结果进行质量控制和结果判读。

13、本发明的引物组和试剂盒，可以降低假阳性率和假阴性率，有效地区分a2亚型和o3亚型，并且可以区分a2亚型和o3亚型的纯合子和杂合子，操作更加简便。