一种同时降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的二肽基肽酶DPPⅢ、编码基因及其应用

本发明属于酶工程，涉及黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的降解，特别是指一种二肽基肽酶dpp ⅲ、编码基因、工程菌及其酶制剂和应用。

背景技术：

1、真菌毒素主要是由丝状真菌如镰刀菌、曲霉和青霉等产生的次生代谢物，主要有脱氧雪腐镰刀菌醇、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、伏马毒素和赭曲霉毒素等，其中最常见的是黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。

2、黄曲霉毒素b1（aflatoxin b1，afb1）是黄曲霉（ aspergillus flavus）和寄生曲霉（ aspergillus parasiticus）产生的次级代谢产物，在谷物加工、运输和储存过程中被广泛检测到。afb1具有较高的致癌性、致畸性、肝肾毒性和免疫毒性。它可以通过多种方式导致细胞毒性，如：细胞内活性氧积累、氧化应激、脂质过氧化、线粒体功能障碍、自噬和凋亡等。此外，afb1可以通过破坏肠道微生物群的代谢途径进一步影响身体的能量供应，从而导致某些代谢性疾病。在1993年，国际癌症研究机构（iarc）将afb1列为ⅰ类化学致癌物。afb1污染多种食品和饲料产品，不仅造成巨大的经济损失，还造成严重的食品安全和人类健康问题。

3、玉米赤霉烯酮（zen）是由镰刀菌产生的一种真菌毒素，广泛分布于玉米、小麦、大麦和高粱和其他谷物饲料及其副产品中。zen熔点高达161-163℃，并且因其化学稳定性强，耐温性好，在存储过程中其稳定性极高，即便在较高温度下也能保持稳定，不易分解。zen的结构与天然雌激素相似，可以与体内雌激素受体结合，作为非甾体雌激素，破坏由激素相关基因调节的生殖激素和睾丸发育系统。zen还可通过氧化损伤、内质网应激、线粒体凋亡、自噬等途径诱导遗传毒性、肝毒性、免疫毒性和细胞毒性。

4、食品和饲料产品中的afb1和zen的解毒通常采用物理、化学和生物方法三种主要策略。物理方法包括分选、研磨、清洗、微波加热、烹饪、烘烤、紫外线照射、伽马照射和光催化，而化学方法通过化学反应将afb1和zen转化，如碱性水解、氨化、臭氧化和过氧化。已发现物理和化学方法可有效解毒afb1和zen；然而，最终产品的毒性和食品特性，如营养价值、感官特性和适口性，仍然值得怀疑。因此，生物解毒方法已成为饲料和食品中afb1和zen净化的最有前途的替代方法。通过微生物进行的生物解毒可以在温和的条件下进行，最大限度地减少食物的营养价值和其他食物特性的损失。其中酶的生物降解改变afb1和zen成更少或无毒的结构，从而达到脱毒的目的。

5、1998年liu等人首次报道了来源于 armillariella tabescens的黄曲霉毒素氧化酶（aflatoxin oxidase，afo），该酶通过氧化呋喃环双键可以实现afb1的降解。不同来源的漆酶也被发现能够降解afb1，如来源于 pleurotus pulmonarius的lac2和 pleurotus  eryngii的 ery4。来源于 rhodococcus jostii的染料脱色过氧化物酶rh_dypb可以将afb1转化为afq1。来自于 mycobacterium smegmatis的f420h2依赖还原酶降低α,β-不饱和酯，导致内酯环的不稳定和最终裂解。来源于 aeromicrobium sp.的水解酶zenh打开zen的酯键，形成低毒性的降解产物。来源于 monosporascus sp.gib2的内酯酶zenm可以有效降解zen。到目前为止，大多数报道的降解酶只能降解特定种类的真菌毒素，这种特异性限制了降解酶在实际应用中的降解效果。因此，寻找和鉴定新的广谱酶类，用于真菌毒素的生物降解刻不容缓。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种二肽基肽酶dpp ⅲ、编码基因、工程菌及其酶制剂和应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种二肽基肽酶dpp ⅲ，其具有与seq id no.1所示的氨基酸序列70%以上的相似度。与本技术氨基酸序列相似度70%以上的氨基酸序列可保留本技术的二肽基肽酶dpp ⅲ的降解功能。

4、进一步的，上述的二肽基肽酶dpp ⅲ，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、编码上述的二肽基肽酶dpp ⅲ的基因。

6、进一步的，上述基因具有与seq id no.2所示的核苷酸序列90%以上的相似度。与本技术核苷酸序列具有90%以上的相似度的核苷酸序列即可表达本技术的氨基酸序列，例如seq id no.3所示，其为大肠杆菌密码子优化后的核苷酸序列，其序列与seq id no.2所示的基因序列的相似度为90%以上。

7、优选的，上述基因的核苷酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示。

8、含有上述的基因的重组质粒。

9、含有上述的重组质粒的工程菌。

10、二肽基肽酶dpp ⅲ，可以应用于黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮脱毒领域。

11、二肽基肽酶dpp ⅲ降解黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的温度为20-80℃，ph为5.0-10.0。

12、二肽基肽酶dpp ⅲ降解黄曲霉毒素b1的最适温度为40℃，ph为7.0。

13、二肽基肽酶dpp ⅲ在温度40-80℃范围内，可以保持80%以上的黄曲霉毒素b1的降解率。

14、二肽基肽酶dpp ⅲ降解玉米赤霉烯酮的最适温度为60℃，ph为8.0。

15、二肽基肽酶dpp ⅲ在温度50-80℃范围内，可以保持85%以上的黄曲霉毒素b1的降解率。

16、二肽基肽酶dpp ⅲ作为一种酶制剂。

17、优选地，二肽基肽酶dpp ⅲ对于黄曲霉污染的花生粕和玉米粉的添加量分别为200 µg/ml和400 µg/ml。

18、该酶制剂可以有效降解黄曲霉污染的花生粕和玉米粉中的afb1。

19、优选地，

20、生物材料在降解真菌毒素中的应用，其特征在于，对黄曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的降解率分别为98.08%和98.80%。

21、本发明具有以下有益效果：

22、1.本技术公开了一种afb1降解酶-二肽基肽酶dpp ⅲ，对afb1降解的最适温度40℃、ph为7.0。该酶对afb1的降解率可达98.08%。同时，二肽基肽酶dpp ⅲ在在温度40-80℃范围内，可以保持80%以上的黄曲霉毒素b1的降解率，是一种可以耐受一定程度高温的afb1降解酶。本发明为食品和饲料工业中的afb1脱毒提供了有希望的候选物。

23、2. 谷物通常很容易受到afb1的污染，特别是花生粕和玉米粉，二肽基肽酶dpp ⅲ对于黄曲霉污染的花生粕和玉米粉中的afb1的降解率为88.2%和89.9%，二肽基肽酶dpp ⅲ为在食品或饲料中afb1的净化提供了有潜力的应用前景。

24、3.该酶也可以有效降解zen，对zen的降解率可达98.80%。