一种TRPV1基因过表达的重组细胞及其构建方法和应用

本发明涉及生物工程，具体涉及一种trpv1基因过表达的重组细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、人结直肠腺癌细胞(caco-2)是一种常用的细胞模型。caco-2细胞虽然起源于结肠，但看起来像人小肠粘膜细胞，在基底外侧和顶室有紧密的连接、刷状边界、外排和摄取转运蛋白。在标准培养条件下，在多孔的可渗透聚碳酸酯膜上的caco-2可融合并分化为与肠上皮具有相同功能和形态的连续的人结肠癌细胞层。由于具有相同的生物活性和模拟人体肠道的微绒毛结构，caco-2细胞模型常被用来进行模拟体内药物转运和吸收机制实验。在过去的几十年里，很多学者对caco-2细胞单层的细胞通透性进行了广泛的研究。结果发现与其他亲代细胞模型相比，caco-2细胞与人小肠上皮细胞类似，比较适合用于吸收机制的研究。辣椒素对肠道脂类吸收的影响的体外实验常采用caco-2作为模型细胞。

2、trpv1是瞬时受体电位家族的一员，是一种无选择的阳离子通道。其作为一个多调受体，可在多种物理、化学因素刺激下激活或致敏，从而介导肌肉收缩、神经元活动、递质释放、细胞增殖和凋亡等多种细胞的基本活动。trpv1是辣椒素的受体，它的激活是辣椒素发挥其降糖降脂作用关键，因此，trpv1基因对于研究辣椒素的作用机理至关重要。

3、目前对于辣椒素功能机理的研究中，trpv1基因过表达对照试验多采用瞬时转染的方法。瞬时转染的方法使用虽然广泛，但是其有一定的局限性。第一，瞬时转染的方法所获得基因表达持续时间较短；第二，瞬时转染的方法所获得基因表达稳定性差；第三，瞬时转染的试剂本身对试验动物或细胞具有一定的毒性作用，用量过多则存在实验失败的可能。

4、因此，有必要提供一种商品化的trpv1过表达细胞模型。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有瞬时转染方法存在的基因表达不稳定、持续时间短且具有毒性等问题，进而提供一种trpv1基因过表达的重组细胞及其构建方法和应用。

2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供一种trpv1基因过表达的重组细胞，所述重组细胞染色体上含有trpv1基因的全基因序列，所述trpv1基因的全基因序列如seq id no.1所示。

4、优选地，所述重组细胞的起始细胞为人结直肠腺癌细胞系caco-2细胞。

5、第二方面，本发明提供用于构建第一方面所述的重组细胞的双酶切引物，所述双酶切引物的核苷酸序列如seq id no.2～seq id no.3所示。

6、第三方面，本发明提供用于构建第一方面所述的重组细胞的过表达载体，所述过表达载体含有trpv1基因的全基因序列，所述trpv1基因的全基因序列如seq id no.1所示；所述过表达载体是采用第二方面所述的双酶切引物扩增所述trpv1基因然后酶切，酶切产物再与同样经过酶切后的空载体连接获得。

7、优选地，所述空载体携带绿色荧光蛋白报告基因。

8、优选地，所述空载体选自pcdh。

9、第四方面，本发明提供一种慢病毒转染系统，包括慢病毒包装质粒和第一方面所述的重组细胞。

10、优选地，所述慢病毒包装质粒由pcdh-trpv、pspax2、pmd这三种质粒组成。

11、第五方面，本发明提供第四方面所述的慢病毒转染系统的构建方法，包括如下步骤：

12、步骤1，将权利要求5或6所述的过表达载体与慢病毒包装质粒混合，再与脂质体混合制备脂质体-载体混合液；

13、步骤2，将所述脂质体-载体混合液转染至293t细胞，优选培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，超离心纯化成不同浓度的浓缩病毒；

14、步骤3，将所述浓缩病毒与polybrene一起感染权利要求1或2所述的重组细胞，通过gfp绿荧光信号筛选，即得。

15、第六方面，本发明提供第一方面所述的重组细胞和/或第二方面所述的双酶切引物和/或第三方面所述的过表达载体和/或第四方面所述的慢病毒转染系统在制备研究辣椒素作用机理用工作菌株中的应用。

16、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

17、本发明构建了一种trpv1基因过表达的人结直肠腺癌细胞系，是利用慢病毒载体系统整合到细胞染色体中，因此trpv1基因过表达的时间持久，稳定性好，无毒副作用，有效解决了使用瞬转试剂的缺陷，为辣椒素降脂、降糖、抗炎症等功能的机理研究奠定物质基础。

18、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

技术特征：

1.一种trpv1基因过表达的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞染色体上含有trpv1基因的全基因序列，所述trpv1基因的全基因序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的起始细胞为人结直肠腺癌细胞系caco-2细胞。

3.用于构建权利要求1或2所述的重组细胞的双酶切引物，其特征在于，所述双酶切引物的核苷酸序列如seq id no.2～seq id no.3所示。

4.用于构建权利要求1或2所述的重组细胞的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体含有trpv1基因的全基因序列，所述trpv1基因的全基因序列如seq id no.1所示；所述过表达载体是采用权利要求3所述的双酶切引物扩增所述trpv1基因然后酶切，酶切产物再与同样经过酶切后的空载体连接获得。

5.根据权利要求4所述的过表达载体，其特征在于，所述空载体携带绿色荧光蛋白报告基因。

6.根据权利要求4所述的过表达载体，其特征在于，所述空载体选自pcdh。

7.一种慢病毒转染系统，其特征在于，包括慢病毒包装质粒和权利要求1或2所述的重组细胞。

8.根据权利要求7所述的慢病毒转染系统，其特征在于，所述慢病毒包装质粒由pcdh-trpv、pspax2、pmd这三种质粒组成。

9.权利要求7或8所述的慢病毒转染系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.权利要求1或2所述的重组细胞和/或权利要求3所述的双酶切引物和/或权利要求4~6任一项所述的过表达载体和/或权利要求7或8所述的慢病毒转染系统在制备研究辣椒素作用机理用工作菌株中的应用。

技术总结本发明提供一种TRPV1基因过表达的重组细胞及其构建方法和应用，该重组细胞是通过将TRPV1基因过表达系统整合到细胞染色体中，将获得的过表达细胞株经过多次传代可以稳定持续地过量表达TRPV1基因，因此TRPV1基因过表达的时间持久且稳定性好，还无毒副作用。TRPV1基因过表达细胞系的建立，为辣椒素降脂、降糖、抗炎症等功能的机理研究奠定物质基础。技术研发人员：王远微,杨佳欣,李婉仪受保护的技术使用者：西南民族大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27