多发性骨髓瘤硼替佐米耐药相关突变体、编码基因及其应用

本发明涉及多发性骨髓瘤硼替佐米耐药相关突变体、编码基因及其应用。属于生物医学。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤等血液系统癌症是由浆细胞克隆增殖引起的。多发性骨髓瘤(mm)中的恶性浆细胞表现出骨髓微环境中大量产生非功能性单克隆免疫球蛋白和快速克隆增殖的特征。多发性骨髓瘤是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大流行病，约占所有血液系统恶性肿瘤的10％。5年生存率平均为38.6％，诊断时70％的病例年龄超过65岁。全球每年新发病例约为160,000例；然而，由于早期发现率受到医疗保健可及性、生活方式因素和遗传易感性差异的影响，因此这一数字在各国之间略有不同。多种骨髓瘤临床表现包括贫血、骨痛和病变、高钙血症、肌酐水平升高和单克隆蛋白(m蛋白)产生。

2、蛋白酶体抑制剂自纳入治疗方案以来，在增强多发性骨髓瘤的预后方面发挥了重要作用。开创性的蛋白酶体抑制剂硼替佐米(velcade；btz)于2003年获得fda批准，最初作为单一注射剂，在治疗复发性多发性骨髓瘤方面发挥了重要作用。自最初批准以来，硼替佐米已被授权用于联合治疗。当与美法仑-泼尼松联合使用时，硼替佐米已被证明优于先前的治疗标准，用于不适合接受大剂量化疗的患者，然后进行自体干细胞移植(hdt-asct)，后者通常仅由美法仑-泼尼松组成。这种组合显著提高了无进展生存期。硼替佐米、地塞米松和沙利度胺的联合治疗已超过自体干细胞移植(autologous stemcell transplantation，asct)前患者的既往治疗标准。2010年，硼替佐米获批用于难治性多发性骨髓瘤(mm)患者的一线治疗。

3、虽然标准疗法最初可有效消除多发性骨髓瘤(mm)细胞，但长期治疗最终会导致耐药性复发。耐药性对mm的治疗构成了重大挑战，就像在许多其他癌症中一样。微小残留病(mrd)是指治疗后残留在体内的少量癌细胞的存在。这些残留细胞通常检测不到且无症状，但可能会增殖并导致疾病复发。治疗后mrd状态的评估既是预后指标，也是治疗效果的标志物。治疗周期后持续存在mrd提示大量多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)细胞未根除，这增加了短期内复发的可能性。即使在初次对治疗有反应的患者中，获得性或继发性耐药也很重要，因为蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitor，pi)耐药性会显著增加。加强对与pi相关的耐药机制的理解将有利于制定更有效的临床治疗策略。

4、靶基因或参与信号转导的其他信号转导基因中的某些靶突变和相关遗传改变可导致先天原发性耐药性。一个例子是在浓度增加的硼替佐米中培养th1细胞，这导致了有史以来第一个与蛋白酶体抑制剂(pi)耐药性相关的点突变。该突变是位于β5亚基(psmb5)结合口袋中催化位点(ala49val)内的簇区的单点突变。研究发现，该突变通过扰乱硼替佐米结合口袋的空间排列而引起耐药性。后来，在β5亚基的硼替佐米结合口袋中发现了更多的突变。最近的一项研究发现，在大约1200名新诊断的多发性骨髓瘤(mm)患者中，只有一个psmb5突变位置y42c。r180q突变是在对卡非佐米(carf)和硼替佐米(bor)耐药的患者亚群中发现的。据报道，一些单点突变会导致结合位点内的构象变化或空间位阻，包括t21a、r24c、m45i、m45v、c52p和c63f。

技术实现思路

1、本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供多发性骨髓瘤硼替佐米耐药相关突变体、编码基因及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

3、1、多发性骨髓瘤硼替佐米耐药相关突变体，所述突变体是dlgap-5或者rbmx发生以下氨基酸的替换突变后形成的：

4、(1)dlgap-5中的第505位天冬氨酸替换为天冬酰胺(d505n)；

5、(2)rbmx中的第221位丝氨酸替换为亮氨酸(s221l)。

6、作为优选的技术方案之一，所述突变体是dlgap-5中的第505位天冬氨酸替换为天冬酰胺(d505n)而得。

7、2、编码前述突变体的多发性骨髓瘤硼替佐米耐药基因。

8、3、前述突变体或基因在制备多发性骨髓瘤硼替佐米耐药检测试剂盒中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗用途。

9、4、试剂盒，包含用于检测前述突变体或基因的特异性引物或探针。

10、本发明的有益效果：

11、本发明公开了一种在硼替佐米(bortezomib)耐药的多发性骨髓瘤病人样本中的一些关键突变基因dlgap-5和rbmx，突变位点分别为d505n和s221l。这两个突变位点是多发性骨髓瘤硼替佐米耐药患者病例中，对比相对正常的大量数据统计分析得到的，并且通过实验室硼替佐米耐药细胞株的实验验证，表明该两个突变位点在细胞水平和临床水平都能重复出现突变，具有较高的可行度。

12、具体地，本发明使用加权基因共表达网络分析(wgcna)检查gse160572数据集，以找到与抗性特征高度相关的中心基因。选定的中心基因将通过基因本体(go)、京都基因与基因组百科全书(kegg)和蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)进行分析。申请人检查这些基因是否在tcga泛癌数据集中显示其他癌症的突变。此外，使用mmrf-compass数据集评估这些基因的突变状态，强调有利或有害突变的识别进行额外检查。使用特定于靶标的引物扩增突变的外显子，并对扩增的dna片段进行测序和检查以确认突变。通过建模和分析使用polyphen、sift、vep修饰因子和ddmut对蛋白进行评估，验证突变对蛋白结构的影响。蛋白结构从alphafold下载。mm1-s和arp-1细胞系用于验证中心基因的表达。此外，使用gse9782数据集研究了这些基因在敏感和耐药患者中的表达。使用gse24080数据集创建kaplan-meier图，评估患者生存与基因表达水平之间的关系。gse160572数据集经历了接收器工作特性(roc)分析，以评估所识别基因的预后意义。

13、现有技术难以通过基因突变位点预测硼替佐米耐药，本发明找到的基因突变位点在硼替佐米耐药多发性骨髓瘤病例中具有普遍性、代表性和显著性，有望为预测多发性骨髓瘤临床上硼替佐米耐药，提供基因突变位点的检测和预测。

技术特征：

1.多发性骨髓瘤硼替佐米耐药相关突变体，其特征在于，所述突变体是dlgap-5或者rbmx发生以下氨基酸的替换突变后形成的：

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是dlgap-5中的第505位天冬氨酸替换为天冬酰胺而得。

3.编码权利要求1或2所述突变体的多发性骨髓瘤硼替佐米耐药基因。

4.权利要求1或2所述突变体或权利要求3所述基因在制备多发性骨髓瘤硼替佐米耐药检测试剂盒中的应用。

5.试剂盒，其特征在于，包含用于检测权利要求1或2所述突变体或权利要求3所述基因的特异性引物或探针。

技术总结本发明公开了多发性骨髓瘤硼替佐米耐药相关突变体、编码基因及其应用。具体是在硼替佐米(bortezomib)耐药的多发性骨髓瘤病人样本中发现的关键突变基因DLGAP‑5和RBMX，突变位点分别为D505N和S221L。这两个突变位点是多发性骨髓瘤硼替佐米耐药患者病例中，对比相对正常的大量数据统计分析得到的，并且通过实验室硼替佐米耐药细胞株的实验验证，表明该两个突变位点在细胞水平和临床水平都能重复出现突变，具有较高的可行度。本发明找到的基因突变位点在硼替佐米耐药多发性骨髓瘤病例中具有普遍性、代表性和显著性，有望为预测多发性骨髓瘤临床上硼替佐米耐药，提供基因突变位点的检测和预测。技术研发人员：孙曙明,刘静受保护的技术使用者：中南大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27