一种检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂及其应用

本发明涉及畜牧兽医学检验检疫及诊断，特别是涉及一种检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂及其应用。

背景技术：

1、牛库布病毒(bovine kobuvirus，bkv)属于小rna病毒科的一个新病毒属库布病毒属，它在动物体内感染率较高，给养牛业造成严重的经济损失。牛库布病毒感染临床上主要以腹泻为主要特征。库布病毒首次于1989年在日本急性胃肠炎病人粪便样品中发现，之后2003年yamashita等在胎牛血清中发现牛库布病毒。国内于2007年首次从腹泻仔猪粪便中分离出库布病毒，证实国内存在库布病毒感染。另外ana s.d.moreira et al.与2017年在牛的脑脊液中也检测到bkv。本实验室于2020年从吉林腹泻牛群中分离到库布病毒病毒，发现国内牛群存在库布病毒感染。该病在国内为新发传染病，严重威胁着养牛业的健康发展。

2、bkv传播迅速，可在腹泻牛群粪便样品中检测出来，随着研究的深入发现库布病毒不仅作用于肠道细胞，还可以穿过血管壁到达血液中，由此可见库布病毒的致病机制较为复杂。由于bkv感染与其它病原体如牛病毒性腹泻病毒、牛细小病毒、牛冠状病毒等引起的临床症状和病理变化有许多相似性，如果牛群继发细菌性或病毒性感染，可使其临床表现和病理变化复杂化，个体间的临床表现差异很大，因此，根据临床症状和病变及流行病学特点很难对本病做出正确诊断，本病确诊需要实验室诊断技术，特别是新发生本病的地区和牛场。

3、虽然国内外已建立了一些bkv诊断方法，如病毒分离、聚合酶链式反应(rt-pcr)和实时定量pcr方法，但上述检测方法需要比较昂贵仪器设备与在条件优良的实验室进行操作，更重要的是这些方法难以用于该病的早期诊断。有关bkv的免疫学方法，尤其是具有特异、敏感、快速与简便、适于在基层牛场应用的检测库布病毒抗原的方法和试剂盒鲜有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用标记异硫氰酸荧光素的多克隆抗体制备的检测试剂，通过直接免疫荧光实验即可用于快速诊断牛库布病毒感染，以及牛库布病毒抗原在组织细胞中的定位和鉴定。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂，包括标记异硫氰酸荧光素的兔源多克隆抗体。

4、优选的是，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列如seq id no:4所示。

5、本发明还提供一种所述的检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂的制备方法，包括以下步骤：利用透析法，用异硫氰酸荧光素标记多克隆抗体，再用葡聚糖凝胶柱层析纯化，即得检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂。

6、优选的是，所述多克隆抗体和所述异硫氰酸荧光素的体积比为1:10，所述多克隆抗体的浓度为10mg/ml，所述异硫氰酸荧光粉的浓度为0.1mg/ml。

7、优选的是，标记条件为：4℃避光磁力搅拌标记24h。

8、本发明还提供所述的检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂在制备检测牛库布病毒或其抗原在组织细胞中的定位和鉴定的试剂盒中的应用。

9、优选的是，利用所述试剂通过直接荧光免疫方法检测牛库布病毒或其抗原。

10、本发明公开了以下技术效果：

11、本发明公开的检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂，利用直接荧光试验可用于临床快速诊断牛库布病毒感染，以及牛库布病毒抗原在组织细胞中的定位和鉴定中。该直接荧光免疫实验具有如下优点，(1)检测时间短：40min内即可报告结果；(2)特异性强：试剂与其他病原体无交叉反应，只检出bkv抗原，具有很高特异性；(3)重复性好，准确性高：与间接免疫荧光方法的符合率为90％以上，可用于牛库布病毒的快速诊断；(4)敏感性高：异硫氰酸荧光素(fitc)标记抗体具有较高的免疫效价，提高了试剂盒的敏感性和特异性；(5)稳定性好：荧光试剂4℃保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异，具有很好的稳定性。

技术特征：

1.一种检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂，其特征在于，包括标记异硫氰酸荧光素的兔源多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂，其特征在于，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列如seq id no:4所示。

3.一种如权利要求1所述的检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用透析法，用异硫氰酸荧光素标记兔源多克隆抗体，再用葡聚糖凝胶柱层析纯化，即得检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体和所述异硫氰酸荧光素的体积比为1:10，所述多克隆抗体的浓度为10mg/ml，所述异硫氰酸荧光素的浓度为0.1mg/ml。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，标记条件为：4℃避光磁力搅拌标记24h。

6.如权利要求1所述的检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂在制备检测牛库布病毒或其抗原在组织细胞中的定位和鉴定的试剂盒中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述试剂通过直接荧光免疫方法检测牛库布病毒或其抗原。

技术总结本发明公开了一种检测牛库布病毒免疫荧光抗体试剂及其应用，属于畜牧兽医学检验检疫及诊断技术领域。所述荧光抗体试剂包括标记异硫氰酸荧光素的多克隆抗体，所述多克隆抗体的抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明公开的荧光抗体试剂能应用于牛库布病毒感染临床快速诊断、检验检疫和以及牛库布病毒在组织细胞中的定位与鉴定中，具有特异性强、稳定性好以及检测时间短等优势。技术研发人员：王新平,郑学博,米日古丽,常晓冉,崔续媛,胡俊英,张群,章凡,张芷源受保护的技术使用者：吉林大学技术研发日：技术公布日：2024/8/27