一种猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae，app)引起的一种接触性传染病，该细菌是一种有荚膜的革兰氏阴性小杆菌。于20世纪50年代被英国科学家首次发现并报道，在全世界范围内广泛存在，依据其荚膜多糖(capsular polysaccharide，cps)和脂多糖(lipopolysaccharide，lsp)的差异现可分为19个血清型，根据其生长过程中是否依赖nad将其分为生物1型和生物2型。

2、app可以传染各个年龄段的猪只，依照动物自身健康状况、环境及应激状况、病原感染程度的不同，临床动物患猪传染性胸膜肺炎发病表现出最急性型、急性型、慢性型等三种类型。最急性病例往往于断奶仔猪群中发生较多，突然发病，发病过程短，患猪初期突发高热，体温高达41.5℃，短期出现轻度呕吐、腹泻，病初没有明显的呼吸困难，后期出现耳、鼻、四肢等部位及全身皮肤发绀，出现呼吸障碍，死亡速度较快，幼仔发病不表现临床病征，突患败血症死亡。急性型表现倦怠，呼吸系统出现不同程度的症状，食欲废绝，发热范围在40.5～4l℃，通常于发病后2至4d内死亡。部分症状缓和的患猪或急性型能够缓慢耐过至痊愈，或者转化至慢性型、亚急性型。一般症状轻微，表现为发热程度不剧烈或微弱，不连续性性咳嗽，是病原菌的携带者，容易与其他病原发生继发感染或混合感染再转为急性病，加重临床症状。据报道，app感染患慢性型病猪，平均每日体重增加减少了33.6％，饲料转化率降低了0.77％至25.5％，给养猪业造成巨大的经济损失，是国际公认的养猪业重要疫病之一。

3、由于抗生素的滥用，导致了耐药菌株的产生，使药物治疗趋向无效、浪费；而抗生素药物的残留，也使得肉用动物在出口时面临不能通过的难题。因此，使用疫苗来预防猪传染性胸膜肺炎是当前最科学、最有效的方法。目前，市面上使用的疫苗主要有灭活疫苗和亚单位疫苗，这些传统疫苗虽在预防和控制传染病过程中起到了重要作用，然而全菌中含有大量不相关和无效的成分可能引起副反应，由于动物机体免疫潜力是有限的，避免疫苗中微生物大量无效成分对动物产生无意义的免疫应答，节约机体的免疫潜力，是当前免疫预防制品应关注的重点。基因工程亚单位疫苗以其安全性高、稳定性好、针对性强等诸多优点，成为新型疫苗的研究热点和焦点，而且其疫苗成分针对性强，无效的成分较少。目前我国已上市的基因工程亚单位疫苗已在防控重大动物疫病中发挥了重要作用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗及其制备方法。

2、因此，本发明一方面提供了一种猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗，所述疫苗包括猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物以及药学上可接受的水包油包水佐剂，其中猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为apxⅰa、apxⅱa或apxⅰa、ompd或apxⅱa、ompd。

3、优选地，本发明所述猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为apxⅰa、apxⅱa、ompd或apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa或apxⅰa、apxⅱa、omla。

4、优选地，本发明所述猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、ompd或apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、omla。

5、优选地，本发明所述的猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物的各蛋白的浓度均为50μg/ml。

6、优选地，本发明所述的药学上可接受的水包油包水佐剂。

7、优选地，本发明所述水包油包水佐剂组分包括注射级白油、α-生育酚、司盘80、吐温80、三七皂苷、ph 6.5的10mm柠檬酸钠缓冲液。

8、优选地，本发明所述的apxⅰa蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述的apxⅱa蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述的apxⅲa蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述的ompd蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述的omla蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。

9、优选地，本发明所述水包油包水佐剂中兽用注射级白油含量为40％～45％，α-生育酚含量为10％～15％，司盘80含量为5％～10％，吐温80含量为10％～15％，三七皂苷含量为5μg/ml～10μg/ml。

10、再一方面，本发明还提供了一种所述的apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、ompd、omla蛋白或蛋白组合物在制备猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗中的应用。

11、本发明采用原核大肠杆菌bl21(de3)-pet28a载体系统，利用生物分子学技术人工构建并筛选得到了高效表达菌株，构建菌株发酵培养表达apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、ompd、omla、tbpb蛋白，通过大量的优化试验，从中筛选了较好的配方和浓度，以用于猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗的制备。

12、本发明筛选的不同猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗免疫后能产生良好的免疫攻毒保护，有效抵御猪胸膜肺炎放线杆菌不同血清型菌株的攻击。因此，本发明研制的猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗的研制不仅能很好的预防猪传染性胸膜肺炎，同时对猪场疫病的净化和保障人类食品安全及健康起着重大作用。

技术特征：

1.一种猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包括猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物以及药学上可接受的水包油包水佐剂，其中猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为apxⅰa、apxⅱa或apxⅰa、ompd或apxⅱa、ompd。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为apxⅰa、apxⅱa、ompd或apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa或apxⅰa、apxⅱa、omla。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、ompd或apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、omla。

4.根据权利要求1～3任一权利要求所述的疫苗，其特征在于，所述的猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物的各蛋白的浓度均为50μg/ml。

5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的药学上可接受的佐剂的水包油包水佐剂。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述水包油包水佐剂组分包括但不限于注射级白油、α-生育酚、司盘80、吐温80、三七皂苷、ph 6.5的10mm柠檬酸钠缓冲液。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述水包油包水佐剂中兽用注射级白油含量为40％～45％，α-生育酚含量为10％～15％，司盘80含量为5％～10％，吐温80含量为10％～15％，三七皂苷含量为5μg/ml～10μg/ml。

8.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的apxⅰa蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示，所述的apxⅱa蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述的apxⅲa蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述的ompd蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述的omla蛋白的氨基酸序列如seq idno.5所示。

9.一种如权利要求1所述的apxⅰa、apxⅱa、apxⅲa、ompd、omla蛋白或蛋白组合物在制备猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗中的应用。

技术总结本发明公开了一种猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗，所述疫苗包括猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物以及药学上可接受的佐剂，其中猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白组合物为ApxⅠA、ApxⅡA或ApxⅠA、OmpD或ApxⅡA、OmpD或ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD或ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA或ApxⅠA、ApxⅡA、OmlA或ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、OmpD或ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、OmlA。本发明还公开了一种所述的ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、OmpD、OmlA蛋白或蛋白组合物在制备猪传染性胸膜肺炎基因工程亚单位疫苗中的应用。本发明制备的基因工程亚单位疫苗具有良好的免疫效果，能够抵抗不同血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌的攻击。因此，本发明的基因工程亚单位疫苗具有良好的应用前景。技术研发人员：柴文琴,吴超,查银河,冯华朋,舒建洪,何玉龙,王芳,林渝钧受保护的技术使用者：杭州依思康医药科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/2