摩氏摩根氏菌的分型分子标志物及其分型方法和应用

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及摩氏摩根氏菌的分型分子标志物及其分型方法和应用。

背景技术：

1、摩氏摩根氏菌（ morganella morganii，也可称为摩根摩根菌），为肠杆菌科摩根菌属兼性厌氧革兰阴性杆菌，在自然界中广泛分布，常存在于人及动物的肠道内，属于机会性致病菌，一般引起患者尿路，伤口等部位的感染。根据是否发酵海藻糖摩氏摩根氏菌分为 morganella subsp. morganii（摩根亚种）和 morganella subsp. sibonii（塞诺亚种）两个亚种。摩氏摩根氏菌具有多种固有耐药机制，如携带ampc酶基因 bladha，对大多数一代和二代头孢菌素类，大环内酯类、林克酰胺类、糖肽类、磷霉素、夫西地酸，多黏菌素类和四环素类天然耐药。此外，摩氏摩根氏菌还携带了种类丰富的获得性耐药基因，包括 blakpc-2， blandm， mcr-1和 tet(x3)，是耐药基因传播的重要储存库。其多重耐药机制使得摩氏摩根氏菌对抗菌药物的耐药率逐年增加，使其成为院内感染重要的病原体。随着摩氏摩根氏菌感染事件的增多，院感爆发事件也逐渐开始出现。早在20世纪八十年代，tucci和isenberg就报道过在一家医院的四个病房中连续出现13例摩氏摩根氏菌感染事件；怀疑是院感爆发事件后，医院加强院感防控手段，才得以解决这一爆发事件。

2、在检测院内细菌爆发事件中，基于多位点序列分型（multilocus sequencetyping，mlst）是常用的手段，其技术原理是通过测定7个管家基因的序列，并根据每个位点序列的不同为其分配等位基因号，七个管家基因的等位基因号共同组成了细菌的序列型（sequence type，st）。然而，在摩氏摩根氏菌中并未建立mlst分型方法。目前，可以对摩氏摩根氏菌全基因组测序分析的方法来研究摩氏摩根氏菌的亲缘关系以此来调查是否发生院内感染。此外，脉冲场凝胶电泳（pfge）也可以用于判断摩氏摩根氏菌是否属于同一克隆。其基于大的dna限制性片段在交替极性的电场中的可变迁移的原理，是一种高度区分性的分子分型技术。还可以通过血清学方法对摩氏摩根氏菌进行分型，摩氏摩根氏菌有34个“o”群和25种“h”抗原，可分66个血清型。最近，bin liu等人开发了基于o-抗原的编码基因wzx和wzy的分子血清学方法，可以把摩氏摩根氏菌分为11种血清型。

3、至今在院内感染的常见细菌——摩氏摩根氏菌中，没有建立一套用于检测院内克隆传播的分子分型的技术手段，比如对于多位点序列分型而言，目前尚未建立摩氏摩根氏菌的mlst体系；对于全基因组测序分析而言，存在成本较高，周期长，对实验人员要求也较高，在临床不易开展等缺点；对于脉冲场凝胶电泳法而言，实验复杂周期长，对实验人员要求高，成本较高，重复性差，分辨率低；对于血清学分析法而言，操作难度高，不易观察结果；对于分子血清学分析法而言，存在部分不携带wzx和wzy基因的摩氏摩根氏菌，故此种方法不具有普遍性，因此难以监测摩氏摩根氏菌的院内爆发事件，这提示急需一种用于监测摩氏摩根氏菌院内爆发的分子分型方法。

技术实现思路

1、根据现有技术，虽然能够知晓摩氏摩根氏菌的全基因序列，而全基因序列中包括诸多基因片段，至今并没有发现适合对摩氏摩根氏菌进行分型的基因片段和技术方案。

2、为了解决以上问题，本发明公开了摩氏摩根氏菌的分型分子标志物，以及分型方法和应用，其中， bladha基因作为分子标志物用于摩氏摩根氏菌的分型。本发明的技术方案简单，快速，易操作，对实验人员要求较低，成本较低，便于不同实验室之间进行比较，对于摩氏摩根氏菌分型的分辨率高，并且对摩氏摩根氏菌的院感监测，分子溯源和系统进化分析具有很高优势。

3、为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

4、本发明的第一方面提供了一种摩氏摩根氏菌的分型分子标志物，所述分子标志物为 bladha基因或其表达产物，所述 bladha基因的核苷酸序列如seq id no.1-31所示。

5、 bladha为摩氏摩根氏菌固有耐药基因，通常位于摩氏摩根氏菌的染色体中，上游为其调控基因blaampr，下游为编码alpha-2-巨球蛋白基因。经本发明人研究发现，目前摩氏摩根氏菌的 bladha基因型别包括31种。

6、本领域技术人员应理解，本发明不以任何方式限制已公开的具体 bladha基因，本发明包括已知的和将来发现的人工或自然改变的 bladha基因。

7、本发明的第二方面提供了一种摩氏摩根氏菌的分型方法，其特征在于，包括如下步骤：

8、(1) 提取待测摩氏摩根氏菌的基因组dna；

9、(2) 将所述待测摩氏摩根氏菌的基因组dna进行扩增；

10、(3) 对扩增产物中的 bladha基因进行测序分析，通过blast比对确定 bladha基因型别。

11、优选地，在步骤(1)中通过煮沸法提取待测摩氏摩根氏菌的dna。

12、优选地，在步骤(3)中通过blast与seq id no:1-31的 bladha型别进行序列比对，确定 bladha基因型别。

13、本发明的第三方面提供了一种检测摩氏摩根氏菌分型的引物，所述引物为能够扩增 bladha基因的序列。

14、在本发明中，检测摩氏摩根氏菌分型的引物是根据 bladha基因的上下游片段设计的，上游为其调控基因blaampr，下游为编码alpha-2-巨球蛋白基因，可以是能够扩增所有 bladha基因的序列。

15、其中，上游调控基因blaampr包含以下序列seq id no.32：

16、tatgggtggaaatatgcagatcaatatgcggatggctgtcataaaatccggtcagacgcggcagcagccagcctgcggcaaatgttcccaccgcaccgactttcacccgctcacggaactgcccgtgagaaaaacactccagagtatccgcaatccggtcaaacgcctcattgagcaccggcagtaatccctcaccttcatgggtcagcaccagtccgcgtgagacgcgggtaaacagcacacagccgagttgttcttccagagccctgacctgctggctgacggcggcatgggtgacattcagctcaatcgccgcacgggtaaaactgagatgacgggcggcggcctcaaaggcgcgcagcgggttaagggggagataacgtctgaccataatccacctgtaagtttttctttaggctcttgttataattaaccgtttgttctgtccggtgaatctgacgatacttgccgccgtcactcacacacggaaggttaattctg

17、其中，下游编码alpha-2-巨球蛋白基因包含以下序列seq id no.33：

18、ttttttccctgaacaggcccctgcggatacgccggggccgtaatttaagattattccttatacaataatttgctttatgggctgttttatggaggatgagagtatcgggcactgacagcttccggctgaaccggatttcactgtgtgctgcggcaaactgatgtcagtctcaacacacagaggaaaatgttgtcatggacgttctgcgttttatcctccgcttaccttttattttgctgcgtctggcggctcgcagtcttgtttatctctttactctgctgggttttctgctgcgcccgttcaccggacggatccgctgggcggtgccgggctgggtgacctttgccggtaatcagcttgcccggctggagcggggtgtaaaccgctatccgaaaaccatatctgccttattattgctgactgctgcggtggcagcgggcagttattacacctggcactggtatcagaacaaaccgaagccggtggatgttgcgccgctgg

19、优选地，所述引物选自以下引物组中的至少一组：

20、(1)正向引物seq id no.34：tgaaggtgatgatttgcggg，

21、反向引物seq id no.35：catcctccataaaacagccca；

22、(2)正向引物seq id no.36：ctgtttgaagggcagtggac，

23、反向引物seq id no.37：caggtgtaataactgcccgc；

24、(3)正向引物seq id no.38：cgtgaggccgaaattatgca，

25、反向引物seq id no.39：cggccgccacgataataaaa；

26、(4)正向引物seq id no.40：gaggccgaaattatgcagca，

27、反向引物seq id no.41：agacagacgcgattccagat。

28、本发明的第四方面提供了 bladha基因或其表达产物在制备用于检测摩氏摩根氏菌的产品中的应用，其中，所述产品包括试剂、试剂盒、芯片、试纸或测序平台中的至少一种。

29、本发明的第五方面提供了一种用于检测以上所述摩氏摩根氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物。

30、优选地，本发明提供了用于检测摩氏摩根氏菌的试剂盒，所述试剂盒包含摩氏摩根氏菌基因组dna提取液、pcr反应液、pcr引物混合液、阳性对照液和阴性对照液。

31、更优选地，所述摩氏摩根氏菌基因组dna提取液包含tris-edta缓冲液，ph=8-8.5；溶菌酶，50-100μg/ml；rna酶10-20μg/ml和蛋白酶k，100-200μg/ml。

32、更优选地，所述pcr反应液为2×pcr反应液，其中包含：0.1-0.2u/μl taq dna聚合酶；400-500μm dntp；15-20mm tris-hcl，ph=8-8.5；50-100mm kcl；3-5mm mgcl2。

33、更优选地，所述引物混合液包含以下引物组中的至少一组：

34、(1)正向引物seq id no.34：tgaaggtgatgatttgcggg，

35、反向引物seq id no.35：catcctccataaaacagccca；

36、(2)正向引物seq id no.36：ctgtttgaagggcagtggac，

37、反向引物seq id no.37：caggtgtaataactgcccgc；

38、(3)正向引物seq id no.38：cgtgaggccgaaattatgca，

39、反向引物seq id no.39：cggccgccacgataataaaa；

40、(4)正向引物seq id no.40：gaggccgaaattatgcagca，

41、反向引物seq id no.41：agacagacgcgattccagat。

42、更进一步优选地，所述引物混合液包含以下引物组：

43、(1)正向引物seq id no.34：tgaaggtgatgatttgcggg，

44、反向引物seq id no.35：catcctccataaaacagccca。

45、更优选地，所述引物混合液中正向引物和反向引物的浓度分别为8-12μm。

46、更进一步优选地，所述引物混合液中正向引物和反向引物的浓度分别为10μm。

47、本发明的第六方面提供了一种以上所述的摩氏摩根氏菌分型分子标志物或以上所述的摩氏摩根氏菌的分型方法或以上所述的引物或以上所述的用于检测摩氏摩根氏菌的产品在构建摩氏摩根氏菌数据库中的应用。

48、本发明的有益效果至少包括：

49、（1）现有的分型方法包括多位点序列分型，目前尚未建立摩氏摩根氏菌的mlst体系；对于脉冲场凝胶电泳法而言，实验复杂周期长，对实验人员要求高，成本较高，重复性差，分辨率低；对于血清学分析法而言，操作难度高，不易观察结果；对于分子血清学分析法而言，存在部分不携带wzx和wzy基因的摩氏摩根氏菌，故此种方法不具有普遍性；全基因组测序分析一般作为分型的金标准，具有准确，精度高等优点，但存在操作繁琐，成本较高，周期长，对实验人员要求也较高，在临床不易开展等缺点。

50、本发明的分型方法简单，快捷，易操作，检测准确，对实验人员要求较低，成本较低，便于不同实验室之间进行比较，对于摩氏摩根氏菌分型的分辨率高，而且本发明的分型方法相比于全基因组测序分析具有同样相似的准确性和特异性，大大节约成本，节省检测时间，提高检测效率，不仅利于临床开展，也有利于对环境或动物菌株进行分析，对于摩氏摩根氏菌的院感监测以及对分子溯源和系统进化分析都具有很高的优势。

51、（2）本发明中以摩氏摩根氏菌的 bladha基因为依据，设计出针对摩氏摩根氏菌的特异性引物，特异性好、灵敏度高、稳定性好、重复性好，使用本发明的特异性引物进行pcr分析，从而实现对摩氏摩根氏菌快速准确地定性检测。

52、（3）本发明公开的用于检测以上所述摩氏摩根氏菌的试剂盒，具有检测效率高，特异性好和准确性高等优点。

53、（4）本发明公开的摩氏摩根氏菌的分型分子标志物，摩氏摩根氏菌的分型方法，引物或用于检测摩氏摩根氏菌的产品都具有非常重要的实际应用价值。

54、本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

55、生物保藏

56、本发明涉及的摩氏摩根氏菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmcc no:29646，保藏时间为：2024年1月17日。