一种靶向编辑猪HNF1A基因的sgRNA及其应用

本发明涉及动物基因工程，具体地说，涉及一种靶向编辑猪hnf1a基因的sgrna及其应用。

背景技术：

1、青少年发病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，mody)是一种单基因型糖尿病，其特征是早发、呈常染色体显性遗传且胰腺β细胞功能缺陷。mody3是以β细胞功能缺陷为特征的单基因糖尿病，在已确诊为糖尿病的人群中约有1％～2％的患者是mody3，该病的发病年龄从10～60岁不等，临床表现也有较大异质性，易被误诊为t1dm或t2dm。在临床表现上，mody3患者有明显的糖尿病家族史，非胰岛素依赖，胰岛素自身抗体多为阴性。已知引起mody的基因主要包括肝细胞核因子(hnf1a、hnf4a和hnf1b)、葡萄糖激酶(gck)、胰岛素(ins)、b淋巴细胞激酶(blk)及neurod1等14种基因。gck、hnf1a、hnf4a和hnf1b基因的突变是引起mody最常见的原因。其中，hnf1a突变导致进行性β细胞功能障碍，从而导致成年早期的糖尿病，是亚洲、欧洲以及北美mody的最常见原因。到目前为止，已经发现超过200种hnf1a的基因突变导致mody3发生。hnf1a突变表现出高外显率：63％的携带者在25岁时患上糖尿病，几乎所有携带者在55岁前患上糖尿病。由于肾葡萄糖重吸收减少，携带者甚至在糖尿病之前患上糖尿。此外，由于高血糖症严重并随着时间的推移而恶化，微血管和大血管并发症的风险与1型糖尿病(t1dm))和t2dm相似。因此，患者需严格控制血糖并密切监测糖尿病并发症。

2、hnf转录因子家族具有相似的结构，包括二聚化域、dna结合域和反式激活结构域。对这些基因的突变进行功能分析发现，它们主要是功能缺失性突变，导致二聚化能力(1-31aa)、dna结合亲和力(91-181aa，198-279aa)、转录活性(280-631aa)或亚细胞定位的缺陷，这取决于突变的位置。hnf1a也称tcf1，该基因位于12号染色体长臂上(12q24.2)，主要分布在肝脏、胰腺、肾脏和肠道等部位，具有调节肝脏的脂质代谢及蛋白质合成、胰腺的胰岛素分泌、肾脏的葡萄糖重吸收等功能，如胰腺中的hnf1a与dna结合以调节靶基因如胰岛素(ins)和葡萄糖转运蛋白2(glut2)在成熟β细胞中的表达；hnf1a参与调节糖异生和相关途径中许多中心限速步骤，结合其产物对正常肝功能至关重要的基因，包括碳水化合物合成和储存、脂质代谢(胆固醇和脂蛋白的合成)、解毒(细胞色素p450单加氧酶的合成)和血清蛋白的合成(白蛋白、补体和凝血因子)；此外，肝脏中的hnf1a与去乙酰化酶互作调节靶基因表达。包括hnf1a在内的hnf家族参与肝脏的发育、功能和肿瘤的生长。hnf-1a全身性敲除、组织特异性敲除或移码突变均能导致严重的代谢紊乱，编码基因第131位精氨酸突变为丝氨酸的个体表现出代谢紊乱，但目前尚无该氨基酸突变的动物模型。

3、猪在体型大小、解剖学、生理学和易于肥胖等方面与人类具有相似性，是一种有吸引力的模式生物，以其建立的诊断方法和治疗措施可以直接应用于人类。猪作为杂食动物，其消化系统和营养代谢特征与人更相似，已成功应用于人类营养代谢相关肥胖、nafld、动脉粥样硬化和糖尿病等方面的研究。猪与人的胰腺在组织学、生理和病理学方面都具有较高的相似性。首先，组织学方面，猪胰腺大小、形状、体内位置及血液供应方面与人类相似；其次，重要功能基因同源性高，如猪与人胰岛素仅在b链的第30位存在一个氨基酸差异，且猪胰岛素应用于人类糖尿病的治疗已有几十年的历史；再次，糖尿病发生过程中，β细胞损伤病理机制相似，猪与人β细胞量减少50％时将降低胰岛素分泌量导致糖耐量受损，且不同于啮齿类β细胞具有显著的增殖能力，因此，促进β细胞增殖似乎并不是预防人和猪高血糖的重要策略。猪禁食引起血糖水平下降时伴随着多种适应机制，包括增加脂肪分解产生脂肪酸和甘油，满足肝脏糖异生和酮体生成的需求，这几乎与人的代谢一致。随着年龄增长，外周组织胰岛素抵抗增加，糖耐量下降，血糖和胰岛素水平也随之稳定上升。由此可见，猪不仅在大体解剖学、生理学、营养代谢和易于肥胖等方面与人相似，其胰腺形态特征、内外分泌细胞组成和分布、胰岛素及肠促胰岛素释放激素同源性等方面亦与人相似，代谢紊乱过程相关的病理机制同样与人相似，是人类胰腺生理和病理学研究的适宜材料。

4、因此，提供一种靶向编辑猪hnf1a基因的sgrna将为基因编辑猪制备和应用奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种靶向编辑猪hnf1a基因的sgrna及其应用。

2、研究发现，hnf-1a基因全身性敲除、组织特异性敲除或移码突变均能导致严重的代谢紊乱，编码基因第131位精氨酸突变为丝氨酸的个体表现出代谢紊乱，目前尚无该氨基酸突变的动物模型。

3、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向编辑猪hnf1a基因的sgrna，其是基于crispr-cas9系统的sgrna，sgrna作用位点位于猪hnf1a基因第2外显子上，sgrna作用位点的dna序列如seq id no:2所示。

4、本发明中，猪hnf1a基因在ncbi中的参考序列编号为nc_010456.5。

5、第二方面，本发明提供含有所述sgrna的crispr-cas9打靶载体。

6、优选地，所述打靶载体的骨架载体为px458。

7、第三方面，本发明提供一种基于crispr-cas9技术的猪hnf1a基因编辑载体，包括所述打靶载体和基因同源重组载体；其中，所述基因同源重组载体包含供体dna，所述供体dna包含猪hnf1a基因第2外显子第391位碱基由c突变为t的核苷酸序列。

8、进一步地，所述供体dna为双链供体dna或单链供体dna。

9、优选地，所述双链供体dna包括供体ssodn及其互补ssodn，它们的核苷酸序列分别如seq id no:6和7所示。

10、第四方面，本发明提供一种hnf1a基因点突变猪胎儿成纤维细胞系，其是将所述基因编辑载体导入猪胎儿成纤维细胞中得到的。

11、第五方面，本发明提供所述sgrna、所述打靶载体、所述基因编辑载体或所述细胞系在制备基因编辑克隆猪中的应用。

12、第六方面，本发明提供一种crispr-cas9介导的猪hnf1a基因点突变的方法，将所述基因编辑载体转入猪胎儿成纤维细胞中，获得猪hnf1a基因第2外显子上第391位碱基由c突变为t的细胞。

13、第七方面，本发明提供所述细胞系的以下任一应用：

14、1)用于研究猪hnf1a基因的功能；

15、2)用于构建hnf1a基因敲除猪；

16、3)用作研究糖脂代谢紊乱疾病的细胞模型或药物筛选模型。

17、第八方面，本发明提供一种利用所述细胞系所构建的hnf1a基因敲除猪在作为研究糖脂代谢紊乱疾病的动物模型或药物筛选模型中的应用。

18、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

19、本发明根据人mody3糖尿病特征典型的hnf1a基因突变位点hhnf1a c.391c>t，经同源比对确定猪打靶位点序列，通过基因编辑获得phnf1a c.391c>t点突变的猪，该猪的遗传基础与人一致。猪在体型大小、解剖学、生理学和易于肥胖等方面与人类具有相似性，作为杂食动物，猪的消化系统和营养代谢特征与人更相似，适宜于人类糖脂代谢紊乱相关疾病的转化医学应用研究，相关诊断方法和治疗措施可以直接应用于人类。