一种具有胞嘧啶脱氨功能的融合蛋白及其应用

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种具有胞嘧啶脱氨功能可应用于人类或动物基因编辑的融合蛋白、表达构建体、碱基编辑系统及其应用。

背景技术：

1、线粒体是重要的半自主细胞器，拥有自己的基因组。人类线粒体基因组是一个16.6kb的双链环状dna(线粒体dna,mtdna))，包含37个基因，编码呼吸链复合物的13个亚基、2个rrna和22个转移rna(trna)。根据mitomap数据，在mtdna中发现了超过19500个单核苷酸变异(snv)，其中超过250个被认为与疾病相关，包括莱伯遗传性视神经神经病、利氏综合征、进行性脑肌病、melas等。线粒体基因编辑为人类细胞系和动物线粒体遗传性疾病的疾病建模以及未来这些疾病的治疗铺平了道路。

2、线粒体基因编辑工具包括工程化锌指核酸酶(zfn)、转录激活子样效应核酸酶(talen)以及成簇规则间隔短回文重复序列(crispr)和crispr相关蛋白(cas)(crispr/cas)。这些基因编辑工具会在使用者选定的基因组位点引入双链dna断裂(dsb)或dna碱基的化学改变(例如胞嘧啶的脱氨处理)。dsb的dna修复以及修复过程中的化学变化会导致使用者所期待的dna序列变异。

3、基于crispr/cas的基因组编辑是最广泛使用的编辑核基因组的技术，但由于crispr的引导rna(grna)组件难以递送到真核生物的细胞器中，因此使用crispr/cas来编辑线粒体基因组是不可行的。目前已经发展出两种类型更有效的依赖转录激活子样效应子(transcription activator-like effecto，tale，也被称为转录激活因子类效应因子，是一种靶向特异dna序列的dna结合域)的细胞器基因编辑技术。

4、第一类是由细菌来源的胞嘧啶脱氨酶结构域(双链dna特异性胞苷脱氨酶，ddda)衍生的胞嘧啶碱基编辑器(ddcbe)，该编辑器的结构如图1所示。其中，ddda是双链dna脱氨酶，因此ddcbe能以双链dna为底物实现碱基编辑。构建ddcbe时，由于ddda具有强细胞毒性，ddda被分裂为dddatoxn和dddatoxc两部分从而避免细胞毒性。实施线粒体基因编辑过程中，一个tale阵列(tale-l)与dddatoxn融合，一个tale阵列(tale-r)与dddatoxc融合；两种融合蛋白均进一步与线粒体转运肽和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)融合。两种融合蛋白靶向线粒体基因组靶标序列后，dddatoxn和dddatoxc得以重新靠近并结合在一起，从而使双链dna的胞苷脱氨，最终以高靶标特异性催化人类线粒体dna(mtdna)中的c·g到t·a的转化。

5、然而，细菌胞苷脱氨酶ddda衍生的胞嘧啶碱基编辑器(ddcbe)在很大程度上仅限于底物dna5'-tc环境中的c到t转换(例如tc到tt转换)，仅适用于生成所有可能的转变(嘌呤到嘌呤和嘧啶到嘧啶)突变的1/8。同时，为避免细胞毒性，ddda被分裂为dddatoxn和dddatoxc两部分，两部分均由tale dna结合域引导到靶标位点。

6、第二类如图2所示，是将foki切口酶、单链特异性胞苷脱氨酶及核酸外切酶与tale阵列及细胞器转运肽融合，细胞器转运肽和tale阵列将融合蛋白靶向目标序列后，foki切口酶和核酸外切酶促使生成单链dna底物，单链特异性胞苷脱氨酶进一步催化单链dna的胞苷脱氨，最终以催化细胞器dna中的c·g到t·a的转化。

7、但cydent包含了一对tale、一个foki切口酶、一个单链特异性胞苷脱氨酶、一个核酸外切酶及一个ugi等多个组分。这些组分由四个启动子驱动表达，这使得最终转化载体大小超过20kb，一方面增加载体组装难度和遗传转化难度，另一方面限制了往cydent载体加入更多其他组件的潜力。

8、因此，更具适用范围和潜力的细胞编辑器仍有待开发。

技术实现思路

1、由此，本发明提供一种可克服基序依赖性且更为简化的适用人类细胞系和动物线粒体基因组以及核基因组的胞嘧啶碱基编辑器，同时本发明还提供了该编辑器的具体应用。

2、本发明的第一方面是提供了一种融合蛋白，其含有胞嘧啶脱氨功能域，该胞嘧啶脱氨功能域包括sdd和ddda的e1347a突变体；上述sdd和ddda的e1347a突变体之间通过接头进行连接，该接头为如seq id no.7所示的氨基酸序列。

3、本发明中，上述sdd包括但不限于sdd7、sdd3、sdd6等中的任一种。在本发明的一种具体实施方式中，上述sdd为sdd7。

4、在本发明的一种具体实施方式中，上述融合蛋白还包括靶向结构域，该靶向结构域为tale。

5、在本发明的一种具体实施方式中，上述融合蛋白还包括一个或多个定位序列，该定位序列为线粒体转运肽(mts)或核定位信号肽(bpnls)。

6、在本发明的一种具体实施方式中，上述融合蛋白还可包括尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂，或上述融合蛋白可与尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂共表达。

7、在本发明的一种具体实施方式中，上述融合蛋白从n端开始依次包括：定位序列、tale、sdd、ddda的e1347a突变体(dddae1347a)以及尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂。其中sdd和dddae1347a之间通过如seq id no.7所示的氨基酸序列的接头进行连接。

8、本发明的第二方面是提供了一组融合蛋白，其包括左融合蛋白和右融合蛋白，其中，左融合蛋白由定位序列、tale-l、e1347a突变体和ugi所组成，所述右融合蛋白由定位序列、tale-r和sdd所组成。

9、在本发明的一种具体实施方式中，上述融合蛋白中的sdd包括但不限于sdd7、sdd3、sdd6等中的任一种。

10、在本发明的一种具体实施方式中，上述融合蛋白中的定位序列为线粒体转运肽(mts)或核定位信号肽(bpnls)。

11、本发明的第三方面一种表达构建体，该表达构建体含有编码如本发明上述第一和第二方面提及的任一种融合蛋白的核苷酸序列。

12、本发明的第四方面是提供了一种碱基编辑系统，该碱基编辑系统含有如本发明上述第一和第二方面提及的任一种融合蛋白，和/或如本发明上述第三方面提及的任一种表达构建体。

13、本发明的第五方面是提供了一种碱基编辑方法，该碱基编辑方法采用如上述第四方面提及的碱基编辑系统与人类或动物的双链dna反应。

14、本发明的第六方面是提供了上述第一和第二方面的任一种融合蛋白、第三方面的表达构建体或第四方面的碱基编辑系统在人类或动物基因编辑领域的应用。

15、本发明提供了可应用于人类或动物基因编辑的包含dddae1347a与sdd的融合蛋白，该融合蛋白包括单融合蛋白模式(单一融合蛋白)和双融合蛋白模式(左融合蛋白和右融合蛋白)。两种模式下该融合蛋白均可实现对双链dna的非5'-tc序列基序依赖性的胞嘧啶脱氨功能，其在保持高碱基编辑效率的基础上极大地克服ddcbe对底物dna5'-tc序列基序依赖性，从而扩大c到t碱基编辑的适用范围。

16、进一步的，上述单融合模式相对简化胞嘧啶碱基编辑器组分，由单体紧凑的tlae融合蛋白即可完成线粒体dna的c到t碱基编辑，从而简化载体构建过程，并使紧凑的胞嘧啶碱基编辑器可便于与更多的组分配合使用。同时，本发明中的胞嘧啶碱基编辑器不局限于人类或动物的线粒体基因编辑，其适用范围扩大到人类或动物的细胞核基因组的碱基编辑。