一种与鹦鹉精子活力和受精率相关的miRNA及其应用

本发明涉及分子标记领域，具体涉及一种与鹦鹉精子活力和受精率相关的mirna及其应用。

背景技术：

1、精子活力是指精液中呈直线前进运动精子所占的百分率，通常用十分制表示。由于只有具有前进运动的精子才可能具有正常的生存能力和授精能力，所以精子活力是评价种公鹦鹉繁殖潜力的首要指标。精子活力对濒危鹦鹉物种繁衍保护和观赏性鹦鹉遗传选育具有重要影响。尤其是随着精液稀释、储存技术的发展以及人工授精技术的普及，优秀种公鹦鹉的配种公母比可以达到1:50。因此，种公鹦鹉精子活力的高低对种蛋受精率的影响远远大于母鹦鹉。调查研究显示，鹦鹉普遍存在精子活力偏低的情况，一定程度上影响了鹦鹉的繁衍和育种进展。因此，提高种公鹦鹉精子活力是濒危鹦鹉物种保护和观赏性鹦鹉选育的重要目标。

2、精子活力性状的常规表型选择方法有以下缺点：

3、1、测定时间长：精子活力性状测定前，需要对种公鹦鹉进行2-3周的采精训练；且由于稳定性原因，每只公鹦鹉需要至少连续测定4次以上，每次测定间隔2天，甚至需要在不同的周龄进行多次测定；

4、2、测定结果受到主观因素影响较大：精子活力需要工作人员通过专业的相差显微镜进行测定，个人的主观判断和对技术掌握的娴熟程度将会对测定结果产生一定的影响，降低准确性；

5、3、计算机辅助精液质量分析系统可以比较客观测定精子活力性状，但是目前相关分析软件主要针对人、牛和猪等哺乳动物。由于鹦鹉精子形态与哺乳动物差异较大，主流的分析软件不适用鹦鹉。单独开发用于鹦鹉精子活力分析的精液质量分析系统价格昂贵；

6、以上缺点导致在公鹦鹉繁殖力的选育上存在测量不准确、人力和物力耗费巨大等问题，增加选育成本，降低选育进展。

7、mirna是一类长度21～25个核苷酸的内源性非编码单链小rna分子，具有在转录后调控基因表达作用。研究表明，mirna在睾丸生殖细胞中广泛表达，对精子发生和精子活力有关重要的调控作用。mirna和其调控的靶基因mrna通常呈负相关，因此通过对精子活力不同的鹦鹉睾丸组织中mirna和mrna表达谱进行高通量测序和联合分析，可以准确的锁定与精子活力性状相关的mirna及关键基因。相关mirna可作为分子标记，实现目标性状的早期和准确选择，加快精子活力性状的选育进展。

技术实现思路

1、本发明主要针对上述技术问题，提供一种与鹦鹉精子活力或受精率相关的mirna，所述mirna为mun-mir-215-5p，其核苷酸序列为5’-augaccuaugaauugacagac-5’(seq idno.1)。

2、另一方面，本发明提供mun-mir-215-5p在调控鹦鹉精子活力中的应用。

3、进一步地，所述调控鹦鹉精子活力是通过提高mun-mir-215-5p的表达了实现的。

4、另一方面，本发明提供检测鹦鹉精子活力或受精率的引物组，其特征在于，所述引物组包含目的mirna的上游引物序列5’-acactccagctgggttctga acgagact-3’(seq idno.2)，下游引物5’-tggtgtcgtggagtcg-3’(seq id no.3)，颈环引物序列5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtctgtca-3’(seq id no.4)，内参上游引物5’-ctcgcttcggcagcaca-3’(seq id no.5)，内参下游引物为5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’(seq id no.6)。

5、另一方面，本发明提供检测鹦鹉精子活力或受精率的引物组另一组引物，所述引物包括检测icam1基因的上游引物序列为5’-ccttcctcaccgtgtactgg-3’(seq id no.7)，下游引物序列为5’-agcgtagggtaaggttcttgc-3’(seq id no.8)，内参基因上游引物序列为5’-atgcagcagatccgcatgt-3’(seq id no.9)，下游引物序列为5’-tcatggtgttcttgcccatca-3(seq id no.10)’。

6、另一方面，本发明提供一种检测鹦鹉精子活力或受精率的荧光定量pcr试剂盒,所述试剂盒包含检mun-mir-215-5p的引物组。

7、优选的，所述试剂盒还包括检测icam1基因的引物组。

8、进一步的，所述试剂盒还包括反转录试剂和荧光定量pcr反应液。

9、另一方面，本发明提供一种选育高精子活力或高受精率亲本鹦鹉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

10、1)利用前述的引物组或试剂盒检测鹦鹉睾丸组织中mun-mir-215-5p的表达水平；

11、2)根据mun-mir-215-5p的表达水平进行筛选高精子活力或高受精率亲本鹦鹉。

12、进一步地，所述步骤1)还包括如下步骤：

13、a)采集待测鹦鹉睾丸组织，并提取rna；

14、b)进行mirna反转录；

15、c)利用前述引物组或试剂盒检测鹦鹉睾丸组织中mun-mir-215-5p的表达水平。

16、进一步地，所述步骤1)还包括如下步骤：

17、d)筛选标准为保留mun-mir-215-5p表达水平由高到低为前30％的个体作为高精子活力或高受精率亲本鹦鹉。

18、另一方面，本发明提供前述引物组或试剂盒在预测鹦鹉精子活力或受精率亲高低中的应用。另一方面，本发明提供前述引物组或试剂盒在遗传标记辅助育种中选育高精子活力或高受精率亲本鹦鹉的应用。

19、与现有技术相比，本发明采用单一分子标记就能够简单有效对鹦鹉的精力活力进行预测，该标记在高低精子活力的样本间差异表达量达到5.8倍，从而可将该分子标记在用于鹦鹉精子活力性状相关的辅助选择育种，降低了选育成本，提高了选育进展。

技术特征：

1.mun-mir-215-5p在调控鹦鹉精子活力中的应用，其特征在于，所述mirna的核苷酸序列为augaccuaugaauugacagac，所述调控鹦鹉精子活力是通过提高mun-mir-215-5p的表达了实现的。

2.用于检测鹦鹉精子活力或受精率的引物组，其特征在于，所述引物组包含目的mirna的上游引物序列5’-acactccagctgggttctgaacgagact-3’，下游引物5’-tggtgtcgtggagtcg-3’，颈环引物序列5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggtctgtca-3’，内参上游引物5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，内参下游引物为5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。

3.用于检测鹦鹉精子活力或受精率的引物组，其特征在于，所述引物组包含检测icam1基因的上游引物序列5’-ccttcctcaccgtgtactgg-3’，下游引物序列5’-agcgtagggtaaggttcttgc-3’，内参基因上游引物序列5’-atgcagcagatccgcatgt-3’，下游引物序列5’-tcatggtgttcttgcccatca-3’。

4.一种检测鹦鹉精子活力或受精率的荧光定量pcr试剂盒,所述试剂盒包含检权利要求2所述引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的引物组。

6.根据权利要求4～5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录试剂和荧光定量pcr反应液。

7.一种选育高精子活力或高受精率亲本鹦鹉的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤1)还包括如下步骤：

9.权利要求2～3任一项所述的引物组或权利要求4～5任一项所述的试剂盒在预测鹦鹉精子活力或受精率亲高低中的应用。

10.权利要求2～3任一项所述的引物组或权利要求4～5任一项所述的试剂盒在遗传标记辅助育种中选育高精子活力或高受精率亲本鹦鹉的应用。

技术总结本发明涉及分子标记领域，具体提供一种与虎皮鹦鹉(Melopsittacus undulatus)精子活力和受精率相关的miRNA及其应用。本发明利用筛选到调控鹦鹉精子活力性状相关的miRNA，所述miRNA可以作为与鹦鹉精子活力相关的分子标记，在鹦鹉精子活力性状的遗传选育中具有重要的应用价值。技术研发人员：谢梅英,侯连杰,江炘垠,柯碧英,梁晓婷,王琳,徐谙为,胡瑾,李静受保护的技术使用者：广东生态工程职业学院技术研发日：技术公布日：2024/9/9