一种动物源性生物材料DNA残留量检测方法与流程

本申请涉及免疫原性检测，尤其涉及一种动物源性生物材料dna残留量检测方法。

背景技术：

1、由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性支架材料被普遍用于外科的创伤修复，肌腱、皮肤、心血管、胃肠及下尿道组织的重建。这些细胞外基质支架材料取材于人和动物的各种组织，如：猪的皮肤、角膜、小肠、尿道及膀胱，牛的皮肤，人的皮肤等。由于细胞膜的表位抗原、同种异体或异种的dna以及由损伤而来的小分子物质可能会引起人体广泛的免疫反应，因此动物源性基质材料的脱细胞过程被认为是非常重要的。尽管细胞外基质材料已经被广泛用于临床，但仍然存在由于残留dna及残留蛋白质等所引起的炎症和免疫反应隐患。因此，动物源性生物材料中，残留dna定量检测是控制产品质量的重要措施之一。

2、基于生物制剂残留dna检测方法主要包括dna探针杂交法及荧光染色法，其中荧光染色法操作简便、灵敏度高、再现性好，得到广泛使用。而dna探针杂交法及荧光染色法检测的待测试样，是否能反映生物制剂残留dna真实含量，成为影响动物源性生物材料中残留dna定量检测的准确性的重要因素。因此有必要提供一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，检测试样能真实的反映动物源性生物材料中残留dna量。

技术实现思路

1、本申请实施例提供一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，以解决相关技术存在的问题，技术方案如下：

2、第一方面，本申请实施例提供了一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，包括以下步骤：

3、将样品进行干燥处理；

4、干燥后的样品经蛋白酶k和tl buffer消化后，先进行裂解，再使用磁珠进行dna提取和纯化；

5、使用磁珠进行dna提取和纯化过程包括使用磁珠吸附dna、磁分离、洗涤、dna洗脱；其中进行磁分离前，先进行离心处理；

6、将提取纯化的dna样品稀释后进行荧光染色法测量；计算dna残留量。

7、在一种实施方式中，样品经蛋白酶k消化时，干燥后的样品与蛋白酶k的加入质量之比为(10-50)：1。

8、在一种实施方式中，蛋白酶k在tl buffer中的浓度为1mg/ml-2mg/ml。

9、在一种实施方式中，消化时的温度为40-55℃，消化的时间为6-48h。

10、在一种实施方式中，裂解的过程为：样品消化后，取上清液，加入rnase a进行第一次孵育；再加入buffer msl进行第二次孵育；完成裂解，得到裂解液。

11、在一种实施方式中，加入上清液和rnase a的体积比为(20-50)：1；第一次孵育的条件为：室温下孵育10-30min；

12、在一种实施方式中，buffer msl溶液加入量为上清液体积的1-2倍；第二次孵育的条件为：60-75℃下孵育5-20min。

13、在一种实施方式中，磁珠吸附dna、磁分离过程为：

14、向裂解液中加入磁珠和乙醇溶液，继续进行第三次孵育；孵育结束，进行4-6s离心；然后放置到磁力架上磁化，进行磁分离，去除上清液，残留物为dna和磁珠。

15、在一种实施方式中，所述磁珠为omega mag-bind particles c。

16、在一种实施方式中，乙醇的加入量为裂解液体积的60％-80％；第三次孵育的条件为：室温下孵育3-10min；磁化的时间为5-30min。

17、在一种实施方式中，洗涤过程为：

18、停止磁化，将磁分离得到的残余物加入含乙醇的buffer mp溶液中混合均匀，并进行4-6s离心；然后放置到磁力架上进行磁化5-20min，去除上清液。

19、在一种实施方式中，经buffer mp溶液洗涤后进一步使用乙醇进行洗涤，过程为：

20、加入乙醇溶液，混匀，进行4-6s离心；室温孵育2-5min，去除上清液；重复1-2次；去除上清液后，室温干燥去除残留液。

21、在一种实施方式中，dna洗脱过程为：

22、洗涤后，停止磁化，加入60-75℃预热的elution buffer溶液，混匀，室温孵育3-10min，再次混匀，离心4-6s，放置到磁力架上磁化，进行磁分离，上清液即为提取和纯化的dna。

23、在一种实施方式中，所述样品为动物源性生物材料。

24、在一种实施方式中，样品置于烘箱中35-38℃干燥至恒重。

25、上述技术方案中的优点或有益效果至少包括：

26、本发明的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，将动物源性生物材料的湿润型样品先干燥处理，以样品的干重作为计算数据，提高dna残留量的准确性。样品经过蛋白酶k消化和裂解后，使用磁珠进行dna提取和纯化；其中进行磁化分离前，先进行短暂的离心处理，使粘在离心管盖子上的磁珠甩落到离心管中，减少dna流失，保证提取和纯化得到的测试样能够真实反映动物源性生物材料中dna的含量，提高dna残留量检测的准确性。

27、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考图表和以下的详细描述，本申请进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。

技术特征：

1.一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，

3.根据权利要求1所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，

4.根据权利要求3所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于

6.根据权利要求5所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于

7.根据权利要求6所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，

8.根据权利要求7所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，

9.根据权利要求7所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于

10.根据权利要求1所述的一种动物源性生物材料dna残留量检测方法，其特征在于，

技术总结本申请提出一种动物源性生物材料DNA残留量检测方法，包括将样品进行干燥处理；干燥后的样品经蛋白酶K和TL buffer消化后，先进行裂解，再使用磁珠进行DNA提取和纯化；使用磁珠进行DNA提取和纯化过程包括使用磁珠吸附DNA、磁分离、洗涤、DNA洗脱；其中进行磁分离前，先进行离心处理；将提取纯化的DNA样品稀释后进行荧光染色法测量；计算DNA残留量。减少了提取和纯化过程中的DNA损失，提高了测量准确度；并且计算的到的DNA含量数值能够真实反应动物源性生物材料中的DNA含量，避免DNA残留量数值而使用动物源性生物材料带来的不安全性问题。技术研发人员：龙俊云,胡康,莫梓茹,黄礼杰,侯怀信受保护的技术使用者：冠昊生物科技股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/12