一种基于突变适配体的快速检测食品中残留甲硝唑的方法

本发明涉及一种基于突变适配体的快速检测食品中残留甲硝唑的方法。

背景技术：

1、甲硝唑(mnz)(metronidazole，mnz)属于硝基咪唑类抗生素，是人工合成的具有5-硝基咪唑基本结构的抗菌抗原虫药物，结构如图1所示，主要用于预防和治疗厌氧菌引起的感染，如呼吸道、消化道、皮肤软组织、骨和骨关节等部位的感染等，此外还被添加于动物饲料中促进动物生长，虽然甲硝唑(mnz)已广泛用于制药，食品和农业行业，但是应当限制剂量水平，因为它对人和动物均有严重的副作用。甲硝唑(mnz)存在致畸、致癌、致突变的潜在风险和遗传毒性，过量摄入甲硝唑(mnz)会造成人体腹泻、头晕、肝脏疾病、贫血、神经疾病等。甲硝唑(mnz)在食品中残留会对消费者的健康产生潜在的危害。因此，各国对于该药物的使用都有严格限制。1998年，欧盟已禁止甲硝唑(mnz)用于食用动物。2002年，美国fda禁止甲硝唑(mnz)在动物源性食品中检出，甲硝唑(mnz)的分子结构式为：

2、

3、甲硝唑(mnz)作为一种常见的抗生素在食品中已有多种检测方法，例如液相色谱-串联质谱法、荧光法、气相色谱法、免疫检测法等。其中仪器分析方法灵敏度高，准确性好，但昂贵的检测仪器、复杂的前处理、特定的仪器安置场所和专业的检测技术人员等条件难以满足市场监督管理、企业自检自控的快速检测需求。免疫分析法检测甲硝唑(mnz)的主要方法是酶联免疫法。目前市场上虽已有一些针对甲硝唑(mnz)残留检测的酶联免疫吸附试剂盒产品，但价格昂贵，酶标抗体的种类有限，操作步骤繁琐，并且由于甲硝唑(mnz)是小分子化合物，本身不具有免疫原性，生产与应用存在较多的限制。这些都在很大程度上限制了免疫分析方法在甲硝唑(mnz)检测中的应用。因此，仍然有必要开发新型、快速、高效、灵敏的食品中甲硝唑(mnz)的残留检测方法。

4、基于核酸适配体的生物传感器检测技术，因为操作简单、高灵敏度、小型化、自动化的优点，已广泛应用于食品安全检测、细胞生理学、药物筛选及靶向、疾病诊断等领域。核酸适配体(aptamer)是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，selex)筛选获得的单链dna或rna片段，其可以高亲和力和高特异性的结合各种目标物，包括各种金属离子、小分子化合物以及蛋白质和活细胞，被称为“化学抗体”。由于核酸适配体可体外合成，具有纯度高、易于修饰、稳定性高等独特优势，已被广泛应用于各种生物传感器中。其中，基于核酸适配体与纳米材料相结合而建立的生物传感器具有结果稳定可靠、操作简单快速、灵敏度高、靶向性强的特点而在各类高效、快速生物传感器的构建中发挥了重要作用。

5、selex是筛选适配体的高通量方法。研究发现基于指数富集系统筛选得到的适配体其特异性、灵敏性和亲和力(kd)仍然有待提升的空间。此外，适配体优化也非常重要。到目前为止，碱基突变策略是提高适配体亲和力的有效方法。碱基突变改变了分子与靶标物质之间的氢键和范德华力，也影响了适配体的空间结构。然而，完全随机突变设计的工作量会很麻烦。研究表明，适配体茎环低能碱基转化为高能碱基，可以改变适配体与靶标之间的相互作用力及空间结构，获得高亲和力的适配体。

6、在过去的三十年里，基于适配体的传感器领域有了很大的发展。基于适配体的生物传感器检测技术具有操作简便、灵敏度高、自动化等特点，在食品安全检测、细胞生理、药物靶向、疾病诊断等领域得到了广泛的应用。适配体生物传感器包括荧光适配体传感器、比色适配体传感器、电化学适配体传感器和表面等离子体共振适配体传感器。其中，基于比色法构建的适配体传感器具有可视化的优点。然而，人眼对颜色变化不够敏感，限制了比色传感器在实时检测平台上的应用。为了解决这一问题，设计了一种基于智能手机的颜色采集装置。该装置基于将比色结果的光信号转换为rgb参数的原理，即在rgb颜色模型中，任何颜色都可以通过三色空间中的颜色坐标来指定。因此，通过智能手机上的取色软件1.2.2版的fcolor picker拍摄待测量区域的图像，可以识别图像色调的细微差异，并通过确定样品浓度与色度值之间的线性或非线性关系来达到快速检测的目的。因此，这种基于智能手机比色方法的传感器在实时检测平台中具有重要价值。

技术实现思路

1、本发明目的在于，提供一种基于突变适配体的快速检测食品中残留甲硝唑的方法，该方法通过对甲硝唑现有的适配体5'-ctg ttt ggt agg cag-3'进行单碱基突变以改善其空间结构以及与靶标之间的相互作用力，从而得到新型适配体—apt1-3：5'ctg tttgct acg cag-3'，并将得到的适配体与金纳米粒子结合构建比色传感器，通过智能手机上的取色软件1.2.2版的f color picker拍摄待测量区域的图像，可以识别图像色调的细微差异，并通过确定样品浓度与色度值之间的线性或非线性关系来达到快速检测的目的。因此，这种基于突变适配体的智能手机比色传感器在实时检测平台中具有重要价值。

2、本发明所述的一种基于突变适配体的快速检测食品中残留甲硝唑的方法，按下列步骤进行：

3、制备适配体：

4、a、首先将甲硝唑适配体序列中的a碱基突变成g碱基，t碱基突变成c碱基，然后通过二级结构分析和三维分子对接，对适配体突变前后的结合能和结构特性进行了对比并用纳米金比色法验证甲硝唑与适配体的结合亲和力；

5、b、将步骤a中的甲硝唑适配体序列中的g碱基突变成c碱基，c碱基突变成g碱基，再通过二级结构分析和三维分子对接，对适配体突变前后的结合能和结构特性进行了对比并用纳米金比色法验证甲硝唑与适配体的结合亲和力，得到5'端的第八个碱基g突变成c碱基时，其亲和力增加了；5'端的第十一个碱基g突变成c碱基时，亲和力增加；

6、c、将步骤b的第八个碱基g和第十一个碱基g同时突变成c碱基得到新的适配体apt1-3:5'-ctg ttt gct acg cag-3'，再通过二级结构分析和三维分子对接，对适配体突变前后的结合能和结构特性进行了对比,并用纳米金比色法、氧化石墨烯荧光法、核酸外切酶法对其亲和力进行表征；得到了更高亲和力的适配体apt1-3：5-'ctg ttt gct acg cag-3'；

7、将适配体apt1-3检测甲硝唑：

8、纳米金的合成：

9、d、通过柠檬酸钠还原haucl4合成金纳米粒子，将10ml柠檬酸钠溶液38.8mm迅速注入100ml沸腾的haucl4 1mm溶液中，剧烈搅拌，在搅拌过程中持续加热10分钟，停止加热并再持续搅拌10分钟，将得到的酒红色溶液冷却至室温，然后保存在深色玻璃瓶中，温度为4℃备用；

10、e、将步骤d得到的体积为300μl的纳米金与200μl步骤c得到的适配体apt1-3：5-'ctg ttt gct acg cag-3'0.06μm在温度25℃下孵育5min，再注入200μl浓度分别为6.7μm、13.3μm、20.0μm、26.7μm、33.3μm、44.4μm的的甲硝唑溶液，在温度25℃下反应25min，加入200μl 40mm nacl混合均匀；

11、f、将步骤e制备好的甲硝唑溶液置于样品板(3)中，将样品板(3)放在3d暗盒内的样品板的放置盒(5)底部的led灯带(4)上，样品板(3)与t型手柄(7)上的天窗(1)对应，将智能手机放置在3d暗盒的顶部t型手柄(7)上，智能手机摄像头对准暗盒顶部的天窗(1)，打开智能手机上1.2.2版的取色软件f color picker，打开该软件的取色器拍摄功能，点击取色器的对准箭头使摄像头对准样品板(3)里的样品，然后点击拍摄按钮，该软件分别给出g和r的值，直接读取g和r的值，用g/r值表征甲硝唑的含量，并建立了线性范围，计算检出限0.15nmol/ml。

12、所述步骤f和步骤g中所述的3d暗盒是由天窗(1)；黑色聚乳酸材料(2)；样品板(3)；led灯带(4)；样品板的放置盒(5)；储电设备(6)；t型手柄(7)组成，在3d暗盒内部四周设有黑色聚乳酸材料(2)，样品板的放置盒(5)的底部设有led灯带(4)，样品板(3)放置在led灯带(4)上与t型手柄(7)上的天窗(1)对应，暗盒顶部为t型手柄(7)，并在t型手柄(7)的上部开有天窗(1)，在样品板的放置盒(5)的外部设有储电设备(6)。

13、本发明所述的一种基于突变适配体的快速检测食品中残留甲硝唑的方法，该方法：

14、首先将甲硝唑(mnz)适配体序列中的a碱基突变成g碱基，t碱基突变成c碱基，然后通过二级结构分析和三维分子对接，对适配体突变前后的结合能和结构特性进行了对比并用纳米金比色技术验证甲硝唑(mnz)与适配体的结合亲和力，结果表明亲和力没有增强；

15、然后将甲硝唑(mnz)适配体序列中的g碱基突变成c碱基，c碱基突变成g碱基，再通过二级结构分析和三维分子对接，对适配体突变前后的结合能和结构特性进行了对比并用纳米金比色技术验证甲硝唑(mnz)与适配体的结合亲和力，结果表明5'端的第八个碱基g突变成c碱基时，其亲和力增加了；5'端的第十一个碱基g突变成c碱基时，亲和力也有所增加了；

16、将原始配体的第八个碱基g和第十一个碱基g同时突变成c碱基得到新的适配体apt1-3，再通过二级结构分析和三维分子对接，对适配体突变前后的结合能和结构特性进行了对比并用实验的方法进行表征，见表1，表2；

17、表1原始适配体和突变适配体,突变的碱基下划线表示

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20、表2突变适配体和原始适配体的紫外分光光度计法检测线性范围、检测限、和分子对接结果

21、(适配体apt1-3的检测范围为6.7-40.0nmol/ml)

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23、

24、此外，通过核酸外切酶、氧化石墨烯荧光和纳米金(aunps)比色技术进一步验证甲硝唑(mnz)与适配体的结合亲和力。

25、与现有的甲硝唑(mnz)适配体相比，通过本发明所述方法获得的适配体亲核力提高了将近两倍，这也使其更好的被应用于构建甲硝唑(mnz)生物传感器。

26、在获得新的适配体apt1-3之后，使用该适配体与金纳米粒子结合构建比色传感器，检测食品中的甲硝唑(mnz)，具体检测步骤：

27、纳米金的合成：

28、通过柠檬酸钠还原haucl4合成金纳米粒子，将10ml柠檬酸钠溶液38.8mm迅速注入100ml沸腾的haucl4 1mm溶液中，剧烈搅拌，在搅拌过程中持续加热10分钟，停止加热并再持续搅拌10分钟，将得到的酒红色溶液冷至室温，然后保存在深色玻璃瓶中，温度为4℃，备用；

29、将体积为300μl的纳米金(aunps)与200μl适配体apt1-3：5'-ctg ttt gct acgcag-3'0.06μm在温度25℃下孵育5min得到混合液，然后在混合溶液中注入200μl浓度分别为6.7μm、13.3μm、20.0μm、26.7μm、33.3μm、44.4μm的甲硝唑(mnz)溶液，在温度25℃下反应25min，再加入200μl 40mm nacl混合均匀；

30、将制备好的甲硝唑(mnz)溶液置于样品板中，然后，将样品板放在3d暗盒上，最后，用智能手机取色软件1.2.2版的f color picker进行取色，用g/r值表征mnz的含量，并建立了线性范围，计算检出限。

31、为了避免环境(光线、角度)对取色的影响，设计了3d暗盒，在不借助仪器的情况下可以达到国标要求，检出限为0.15nmol/ml，该方法在食品安全检测领域具有广阔的应用前景。

32、本发明所述的一种基于突变适配体的快速检测食品中残留甲硝唑的方法，该方法在不使用3d暗盒检测时，将样品板直接放在台面上，用智能手机摄像头对准样品板，打开智能手机上取色软件f color picker(1.2.2版)，打开该软件的取色器拍摄功能，点击取色器的对准箭头使摄像头对准样品板里的样品，然后点击拍摄按钮。该软件会分别给出g和r的值，直接读取g和r的值。

33、比色原理验证：金纳米(aunps)粒子表面呈负电性的柠檬酸盐离子通过静电斥力使金纳米(aunps)稳定分散在溶液中，存在nacl时，金纳米(aunps)表面的负电荷被溶液中的阳离子中和，导致金纳米(aunps)之间的静电作用力减小而引起聚集，溶液颜色相应地发生改变(游离金纳米为红色，聚集的金纳米为蓝灰色)。当甲硝唑(mnz)核酸适配体通过静电作用吸附在金纳米(aunps)的表面时，可以增强金纳米(aunps)在nacl中的稳定性，使金纳米(aunps)粒子在高盐浓度下呈游离状态。加入甲硝唑(mnz)后，由于甲硝唑(mnz)与核酸适配体之间具有更强的亲和力，故核酸适配体从金纳米(aunps)表面脱落，导致金纳米(aunps)在nacl的作用下发生聚集，溶液颜色发生变化。金纳米(aunps)的颜色变化与其最大吸收峰也紧密相关，随着金纳米(aunps)聚集，粒径增大，其最大吸收峰波长也增大，一般可用520nm和650nm处的吸收峰代表游离和聚集的金纳米(aunps)的相对数量，记录各溶液颜色和紫外吸收光谱的变化并使用透射电镜观察金纳米(aunps)的聚散状态。

34、适配体亲和力的表征和理论验证：

35、甲硝唑(mnz)与适配体的分子对接模拟：

36、pubchem数据库提供了小分子甲硝唑(mnz)的三维结构(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，chem3d用于优化下载的化合物，将其转化为mol2格式，将小分子化合物导入auto dock tools软件，原子电荷和指定的原子类型，默认情况下，所有灵活的关键点都是可旋转的，最后以pdbqt格式保留最佳构象作为对接配体，利用核酸结构建模服务器rnacomposer(https://rnacomposer.cs.put.poznan.pl/)预测适配体的结构，将碱基t替换为u；利用分子动力学程序amber20将适配体结构中的u修复为t；amber14sb被选为力场参数，能量被保持在最低限度，它最终被作为对接适配体保存了下来；利用autodock4.2测定甲硝唑(mnz)与适配体的结合自由能；利用拉马克遗传方法进行分子对接计算；结合自由能用来评价最终的对接结构；对接结果用pymol 2.1软件进行处理；

37、分子动力学模拟：

38、利用amber 2020对适配体-甲硝唑(mnz)配合物进行了分子动力学模拟；适配体采用amber14sb力场参数，mnz采用gaff通用力场参数，选择tip3p优势水模型，适配体中的原子距离水盒边缘的最小距离为1.0nm，为了平衡系统电荷，采用钠离子或氯离子，在分子动力学模拟工作流程中有四个步骤:加热、平衡、生产动力学模拟和能量最小化；用mmpbsa法计算了适配体与甲硝唑(mnz)的结合自由能；

39、适配体亲和力的表征与验证实验：

40、基于比色法验证适配体的亲和力：

41、比色分析方法为：将体积为300μl的aunps与200μl适配体apt1-3 5'ctg ttt gctacg cag-3'0.06μm，在温度25℃下孵育5min后注入200μl浓度分别为6.7μm、13.3μm、20.0μm、26.7μm、33.3μm、44.4μm的甲硝唑(mnz)溶液，在温度25℃下反应25min，加入200μl 40mmnacl混合均匀，在400-800nm紫外光谱范围内测定光谱图，建立可检测的线性范围(lod＝3σ/s，s为线性斜率，σ为11个空白样品测定值的标准差)；

42、基于氧化石墨烯荧光法验证适配体的亲和力：

43、用氧化石墨烯荧光法测定kd值，测定适配体:apt0,apt8,apt11,apt1-3与甲硝唑(mnz)结合的kd值，5′端修饰fam的适配体在温度95℃下变性10min，随即冰浴10min，然后用100μl(1.5μm)甲硝唑(mnz)与0-250nm适配体振荡2h；最后加入(go/适配体)质量比为50/1(200μl,2mg/ml)的氧化石墨烯，等待30min测量荧光强度；然后记录荧光强度(激发波长为485nm，发射波长为520nm)；可以计算出适配体与甲硝唑(mnz)的亲和力(kd值)，根据公式δf＝bmax*ssdna/(kd+ssdna)，通过oring2022软件进行拟合，(δf＝f-f0，实验组荧光强度用f表示，阴性对照组荧光强度用f0表示，添加的适体浓度用ssdna表示，最大荧光强度用bmax表示)；

44、基于核酸外切酶法验证适配体的亲和力：

45、外切酶法进一步验证适配体:apt0,apt8,apt11,apt1-3与甲硝唑(mnz)结合亲和力，取100μl(100nm)适配体和100μl甲硝唑(mnz)(0.25μm)在温度25℃下孵育30min，然后与等浓度混合均匀的100μl(15u/ml)外切酶ⅰ和ⅲ在温度25℃下孵育60min，最后将300μl混合溶液注入100μl(0.2x sybr gold)中，在温度25℃下反应25min，记录荧光强度(激发波长490nm，发射波长540nm)；

46、智能手机比色分析：

47、将体积为300μl的纳米金(aunps)与200μl适配体(0.06μm)在温度25℃下孵育5min后，注入200μl浓度分别为6.7μm、13.3μm、20.0μm、26.7μm、33.3μm、44.4μm的甲硝唑(mnz)溶液，在温度25℃下反应25min，加入200μl 40mm nacl混合均匀，将制备好的甲硝唑(mnz)溶液置于样品板(3)中，将样品板(3)放在3d暗盒内的样品板的放置盒(5)底部的led灯带(4)上，样品板(3)与t型手柄(7)上的天窗(1)对应，将智能手机放置在3d暗盒的顶部t型手柄(7)上，智能手机摄像头对准暗盒顶部的天窗(1)，打开智能手机上1.2.2版的取色软件fcolor picker，打开该软件的取色器拍摄功能，点击取色器的对准箭头使摄像头对准样品板(3)里的样品，然后点击拍摄按钮，该软件分别给出g和r的值，直接读取g和r的值，用g/r值表征甲硝唑的含量，并建立了线性范围，计算检出限0.15nmol/ml；

48、3d暗盒的设计：

49、为了提高检测方法的便利性，建立了一个基于rgb模型的智能手机设备，它通过智能手机软件分析rgb值，读取检测系统的颜色变化；该方法在不使用3d暗盒检测时，将样品板直接放在台面上，用智能手机摄像头对准样品板，打开智能手机上取色软件f colorpicker(1.2.2版)，打开该软件的取色器拍摄功能，点击取色器的对准箭头使摄像头对准样品板里的样品，然后点击拍摄按钮，该软件会分别给出g和r的值，直接读取g和r的值。但是，在不使用3d暗盒的情况下，由于时间、光线、拍摄角度等的影响，用智能手机取色软件直接拍摄样品给出的g和r值往往偏差较大。因此，为了避免环境因素的影响，使用cad绘图和3d打印技术设计了暗盒，所述的3d暗盒是由天窗(1)；黑色聚乳酸材料(2)；样品板(3)；led灯带(4)；样品板的放置盒(5)；储电设备(6)；t型手柄(7)组成，在3d暗盒内部四周设有黑色聚乳酸材料(2)，样品板的放置盒(5)的底部设有led灯带(4)，样品板(3)放置在led灯带(4)上与t型手柄(7)上的天窗(1)对应，暗盒顶部为t型手柄(7)，并在t型手柄(7)的上部开有天窗(1)，在样品板的放置盒(5)的外部设有储电设备(6)。

50、暗盒内衬黑色吸收材料(2)，可阻挡从可见光到红外光(250-2000nm)的内部随机反射，半球反射率小于1％可有效防止取色过程中的杂散光干扰和内部反射，并且暗盒高13cm可以使手机在取色过程中完美聚焦，暗盒宽8cm，长13cm，总体积大概1.4平方分米，小巧便于携带；3d暗盒与智能手机取色软件f color picker(1.2.2版)完美结合，在样品板(3)中加入浓度分别为6.7μm、13.3μm、20.0μm、26.7μm、33.3μm、44.4μm的甲硝唑(mnz)进行取色和计算，实验结果表明：在6.7-44.4nmol/ml范围内，g/r值与mnz浓度呈线性关系(r2＝0.981)，检测限(lod)为0.15nmol/ml。

51、与现有的检测方法相比：该方法不需要借助仪即可用于现场快速检测。