耐热碱性磷酸酶的制作方法

本发明涉及碱性磷酸酶肽、特别是微生物碱性磷酸酶肽以及它们的用途和应用，所述肽是序列改变的突变肽，具有增加的耐热性，同时保持酶活性，所述用途和应用包括在动物饲料、饲料添加剂中，以及对动物有益的健康和生长效果中的用途和应用。

背景技术：

1、酶，包括溶菌酶和碱性磷酸酶，被认为是细菌碎片和炎症的破坏者。这些酶减少炎症，包括通过裂解细菌的肽聚糖和脂多糖(lps)，从而使其失活，进而绕过或消除炎症反应。碱性磷酸酶(ap)是一种复杂的酶，是一种在活性位点有三个参与催化的金属离子的同源二聚体。ap的结构和机制已经从几个来源进行了广泛的研究，包括从大肠杆菌中提取细菌碱性磷酸酶的工作。ap也被广泛用作生物医学诊断试剂盒中的试剂，在用于健康监测的血液化学分析过程中直接测量，在牛奶巴氏灭菌过程中也测量ap水平。因此，已经开发了各种各样的底物和测定方法来处理和评估这种酶(gonzalez-gil，s等人(1998)marine ecologyprogress series164:21-35)。所述酶具有水解磷酸单酯的相对非特异性活性，这一事实利用许多比色和荧光底物创造了许多测定机会。zn++和mg++离子参与结构和功能可导致复杂的金属离子抑制/激活模式(dealwis，cg等人(1995)biochemistry 34(43):13967-13973；davidson，df(1979)enzyme microb technol 1:9-14)。

2、碱性磷酸酶(ap)是催化磷酸单酯水解和反磷酸化反应的同源二聚酶。ap天然存在于哺乳动物体内，分为四种类型：组织非特异性ap(tnap)、胎盘ap(plap)、生殖细胞ap(gcap)和肠道ap(iap)。肠碱性磷酸酶(iap)是一种锚定在小肠顶膜上的糖蛋白，在十二指肠中含量最高，其次是空肠和回肠。iap具有多种生物学作用，包括作为肠道脂肪吸收的负调节因子，维持碳酸氢盐分泌和ph平衡，以及发挥免疫保护作用。iap的表达依赖于肠细胞的分化；因此，所述酶经常被用作小肠中异常消化和吸收功能的生物标志物。碱性磷酸酶在体内的一个重要作用是对肠腔中存在的细菌lps进行解毒。

3、许多评估碱性磷酸酶益处的研究利用了哺乳动物iap亚型，该亚型通常来源于猪或牛。从哺乳动物宿主获得iap需要对动物实施安乐死并刮取小肠粘膜，然后采用各种消化和分离技术。这一过程需要土地和金钱来饲养动物和喂养它们，产生负面环境输出，并且由于日粮、疾病状态和遗传因素，动物之间的酶活性存在差异。此外，它需要大量的动物来获得少量的酶。总的来说，对于高度可变的产品来说，这会带来巨大的经济和环境成本。

4、微生物酶应用于多个领域，并具有大量的生物技术应用。细菌宿主可以被工程化以快速有效地过表达重组酶，然后大量培养以产生大量所需的酶(liu l等人(2013)bioengineered 4(4):212-223；doi:10.4161/bioe.24761)。微生物的快速生长速度和简单的要求使其成为一种更可持续、更经济、更环保的选择。微生物衍生酶由于其一致性、易于优化、定期供应和更高的催化活性而正在取代传统的酶生产方法。

5、碱性磷酸酶，包括作为饲料酶提供的碱性磷酸酶，有可能成为家禽和猪的独特和有用的产品，特别是考虑到ap在消化道中的作用。微生物碱性磷酸酶组合物(包括饲料或饲料添加剂)的生产需要活性和有效的酶多肽的可用性，所述酶多肽是耐热的，并且可以通过制造过程(包括例如饲料造粒或添加剂制备过程)保持其活性和有效性。需要用于各种用途、组合物、应用和方法中的任何一种的耐热和活性ap酶多肽。

6、本文引用的参考文献不应被解释为承认这是本发明的现有技术。

技术实现思路

1、本发明涉及具有耐热性和在升高的温度下长时间孵育保持活性的突变碱性磷酸酶肽作为用于各种用途和应用的候选和肽。在一个特定方面，所述突变的碱性磷酸酶肽是迟缓类芽孢杆菌(paenibacillus lentus)碱性磷酸酶的变体或突变体。突变型碱性磷酸酶肽包含一种或多种使肽耐热的变体、改变的或修饰的氨基酸。突变型碱性磷酸酶肽包含一种或多种变体、改变或修饰的氨基酸，其使肽的热稳定性在至少10℃的温度下提高。在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶肽在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃、高达95℃的处理或孵育后保持与天然ap酶磷酸酶活性没有显著差异的磷酸酶活性。在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶肽在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃、高达95℃下处理或孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、最多10分钟、最多15分钟、最多20分钟后，保留与天然ap酶磷酸酶活性没有显著差异的磷酸酶活性。突变的碱性磷酸酶肽具有改进的和有用的特性，以提供更大的效用和应用，包括作为饲料添加剂和在动物中，包括在动物健康中。

2、在一个实施方案中，提供了耐热细菌碱性磷酸酶多肽，所述多肽包括：

3、(a)多肽

4、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhx1nninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgix2tssax3agtax4atgnktx5naaisvsnedvsrpfasvx6eaaelsgkstglvttarithatpavyx7shvrx8rdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtx9eekgkrndknllpefeakgykvvkx10gqslkslsakdakvlglfggshix11yvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhax12handfptmvqex13lx14fdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslx15rdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnssx16itidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:2)

5、其中

6、x1是i或l，

7、x2是i，

8、x3是a，

9、x4是i，

10、x5是n，

11、x6是h或f，

12、x7是g，

13、x8是n，

14、x9是n，

15、x10是n，

16、x11是p，

17、x12是a，

18、x13是m、v、t或e，

19、x14是a或e，

20、x15是g或a，

21、x16是e；

22、(b)多肽：

23、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhinninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgivtssasagtalatgnktynaaisvsnedvsrpfasvleaaelsgkstglvttarithatpavyashvrnrdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtneekgkrndknllpefeakgykvvktgqslkslsakdakvlglfggshiayvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhaghandfptmvqealdfdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslsrdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnsssitidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:3)；或

24、(c)(a)或(b)的变体，其中所述碱性磷酸酶多肽的变体保留与耐热突变酶seq idno:1没有显著差异的磷酸酶活性。

25、在一个实施方案中，提供耐热细菌碱性磷酸酶多肽，表示为apht，所述多肽包含：

26、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhinninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgiitssaaagtaiatgnktnnaaisvsnedvsrpfasvheaaelsgkstglvttarithatpavygshvrnrdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtneekgkrndknllpefeakgykvvkngqslkslsakdakvlglfggshipyvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhaahandfptmvqemlafdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslgrdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnsseitidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:1).

27、在一个实施方案中，提供了耐热细菌碱性磷酸酶多肽，所述多肽包括：

28、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhinninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgivtssasagtalatgnktynaaisvsnedvsrpfasvleaaelsgkstglvttarithatpavyashvrnrdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtneekgkrndknllpefeakgykvvktgqslkslsakdakvlglfggshiayvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhaghandfptmvqealdfdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslsrdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnsssitidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:3)。

29、在其它实施方案中，提供耐热细菌碱性磷酸酶多肽，其中所述多肽包含seq idno:18-73中任一项的多肽。

30、在一些实施方案中，耐热碱性磷酸酶多肽进一步包含n端前导序列。

31、在一些实施方案中，n端前导序列是2-10个氨基酸的序列，并且其中前导序列不改变磷酸酶的耐热性或酶活性。

32、在一些实施方案中，n端前导序列选自seq id no:10、13、16和17。

33、在一些实施方案中，包括并提供耐热细菌碱性磷酸酶多肽的变体，其中一个或多个额外的氨基酸被改变或取代。在一些实施方案中，包括并提供耐热细菌碱性磷酸酶多肽的变体，其中一个或多个、一至六个、至少一个、一个或两个、一个或至多三个、一个或者至多4个、一个或至多5个、一个或至多6个、一个或至多7个、一个或至多8个、一个或至多9个、一个或至多10个另外的氨基酸被改变或取代。在实施方案中，所述变体保持耐热性。在实施方案中，变体保持耐热性或是耐热的。在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶肽的变体在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃、高达95℃下处理或孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、高达10分钟、高达15分钟、高达20分钟后，保留与天然ap酶磷酸酶活性没有显著差异的磷酸酶活性。在一个实施方案中，突变碱性磷酸酶肽的额外变体在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃、高达95℃下处理或孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、高达10分钟、高达15分钟、高达20分钟后，保留与耐热突变酶seq id no:1没有显著差异的磷酸酶活性。在一些实施方案中，该变体在序列上不对应于seq id no:4。在一些实施方案中，变体在氨基酸序列上与seq id no:1、2或3具有95％、96％、97％、98％或99％的相同性。在一些实施方案中，变体在氨基酸序列上与seq id no:1、2或3具有95％、96％、97％、98％或99％的同一性，并且在序列上不对应于seq id no:4。

34、在实施方案中，本文提供组合物，特别是饲料添加剂或饲料组合物。饲料添加剂或饲料组合物包含一种或多种如本文所提供的突变体耐热碱性磷酸酶。饲料添加剂或饲料组合物可包含一种或多种突变的耐热碱性磷酸酶或其耐热变体，如本文所提供的。

35、在一些实施方案中，饲料添加剂或饲料组合物包含seq id no:1、2、3或18-73所示的突变碱性磷酸酶多肽。在一些实施方案中，饲料添加剂或饲料组合物包含seq id no:2所示的突变碱性磷酸酶多肽。在一些实施方案中，饲料添加剂或饲料组合物包含seq id no:1所示的突变碱性磷酸酶多肽。

36、在一些实施方案中，饲料添加剂或饲料组合物可包含seq id no:1、2、3或18-73所示的突变碱性磷酸酶多肽，其量为4000iu/kg、10000iu/kg、12000iu/kg、20000iu/kg、40000iu/kg、100000iu/kg、至多200000iu/kg。

37、在一个实施方案中，本发明提供了一种突变的碱性磷酸酶，表示为apht，所述多肽包含：

38、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhinninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgiitssaaagtaiatgnktnnaaisvsnedvsrpfasvheaaelsgkstglvttarithatpavygshvrnrdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtneekgkrndknllpefeakgykvvkngqslkslsakdakvlglfggshipyvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhaahandfptmvqemlafdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslgrdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnsseitidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:1)。

39、在一个实施方案中，本发明提供了一种耐热的突变碱性磷酸酶，所述多肽包括：

40、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhx1nninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgix2tssax3agtax4atgnktx5naaisvsnedvsrpfasvx6eaaelsgkstglvttarithatpavyx7shvrx8rdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtx9eekgkrndknllpefeakgykvvkx10gqslkslsakdakvlglfggshix11yvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhax12handfptmvqex13lx14fdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslx15rdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnssx16itidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:2)；

41、其中

42、x1是i或l，

43、x2是i，

44、x3是a，

45、x4是i，

46、x5是n，

47、x6是h或f，

48、x7是g，

49、x8是n，

50、x9是n，

51、x10是n，

52、x11是p，

53、x12是a，

54、x13是m、v、t或e，

55、x14是a或e，

56、x15是g或a，

57、x16是e。

58、在一个实施方案中，本发明提供了一种突变的碱性磷酸酶，表示为2051，所述多肽包含：

59、essngqsknlivligdgmgpaqvsaaryfqqhinninslnldpyyvgqattyadrgedgghivsgivtssasagtalatgnktynaaisvsnedvsrpfasvleaaelsgkstglvttarithatpavyashvrnrdnenaiafqyldsgidvllgggesffvtneekgkrndknllpefeakgykvvktgqslkslsakdakvlglfggshiayvpdrsdetpslaemtskaleilstnengfaimieggridhaghandfptmvqealdfdeafkvaidfakkdgntsvvvtadhetgglslsrdniyelnvdlwnkqknsseslvsalneaktiadvkkivsdntwitdltneeaqyildgdgssykreggynaviskrllvgwsghghsavdvgvwaygpiadkvkgqidntriatasaevlgvdlkkatadlqskylypkfkinrnkevlfpakplaealggkyqaangtatisgmsgtitvdlnakkaklsgnsssitidvdndvlylpltafsqitgqtlkwdalserimlk(seq id no:3)。

60、在一个实施方案中，本发明提供seq id no:2的突变碱性磷酸酶。在一个实施方案中，本发明提供seq id no:2的突变体碱性磷酸酶，其中所述突变体包含seq id no:18-73中任一项中所述的酶氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中，本发明提供seq id no:18-73中任一项所述的突变碱性磷酸酶。在一个实施方案中，本发明提供seq id no:1、3或18-73中任一项所述的突变碱性磷酸酶。

61、在一个实施方案中，突变碱性磷酸酶多肽包括前导序列或n端附加氨基酸。在一个实施方案中，前导序列或n端附加氨基酸的长度为2至15、2至10、约5-7、约4-8个氨基酸。在一个实施方案中，前导序列或n端附加氨基酸不改变酶活性或影响(增加或降低)突变碱性磷酸酶多肽的耐热性。在一个实施方案中，前导序列或n端额外的氨基酸提供碱性磷酸酶的增加的表达或溶解性或稳定性。本文提供的示例性和使用的前导肽序列包括asra(seq idno:10)和asgfyvsgt(seq id no:13)。

62、在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶多肽最初与较长的n端附加肽序列合成，然后可以对其进行处理以留下较短的前导肽。在本文的一些实施方案中，示例性较长的n端附加肽序列包括前导序列seq id no:16和seq id no:17。处理这些较长的n端的额外肽序列前导，以将较短的剩余前导肽n端提供给突变的碱性磷酸酶多肽，例如seq id no:10和13。

63、在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶多肽包含seq id no:1、2、3或18-73中列出的氨基酸序列，并且进一步包含不改变或显著降低其活性的n端前导或另外的n端氨基酸序列。在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶多肽包含seq id no:1或2中列出的氨基酸序列，并且进一步包含不改变或显著降低其活性的n端前导或另外的n端氨基酸序列。在一些实施方案中，n端前导或另外的n端氨基酸序列可以提高突变的碱性磷酸酶多肽的活性、稳定性或表达。包括这样的n端前导或另外的n端氨基酸序列的示例性突变酶包括seq id no:7、8、12和15。

64、本文详述的突变型碱性磷酸酶多肽的其他变体作为实施方案包括在内，特别是其中变体保持耐热性或耐热性。在一个实施方案中，突变的碱性磷酸酶肽的附加变体在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃和高达95℃处理或孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、高达10分钟、高达15分钟和高达20分钟后，保留与天然ap酶磷酸酶活性没有显著差异的磷酸酶活性。在一个实施方案中，突变碱性磷酸酶肽的额外变体在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃、高达95℃下处理或孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、高达10分钟、高达15分钟、高达20分钟后，保留与耐热突变酶seq id no:1没有显著差异的磷酸酶活性。在一些实施方案中，变体相对于野生型ap酶或非耐热ap酶，如seq id no:4中所述，保留seq id no:2中所述的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个氨基酸变化。在一些实施方案中，变体相对于野生型ap酶或非耐热ap酶，如seq id no:4中所述，保留seq id no:2中所述的至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个氨基酸变化。在一些实施方案中，与野生型ap酶或非耐热ap酶，例如seq id no:4中所述相比，变体保留seq id no:2中所述的至少4个、至少6个、至少8个、至多16个氨基酸变化。在一些实施方案中，变体相对于野生型ap酶或非耐热ap酶，如seq id no:4中所述，保留seq id no:2中所述的多达16个氨基酸变化，并且还包括多达2个、多达3个或多达4个氨基酸变化。在一些实施方案中，变体相对于野生型ap酶或非耐热ap酶，如seq id no:4中所述，保留seq id no:2中所述的多达16个氨基酸变化，并且还包括1、2或3个氨基酸变化。在一些实施方案中，变体相对于野生型ap酶或非耐热ap酶，如seq id no:4中所述，保留seq id no:2中所述的至少4个、至少6个、至少8个、至多16个氨基酸变化，并且还包括1个、2个或3个另外的氨基酸变化。在一些实施方案中，变体保留氨基酸序列变化和对应于seq id no:2中所述的序列，并且进一步包括1、2或3个额外的氨基酸变化。在一些实施方案中，变体保留氨基酸序列变化和对应于seq id no:2中所述的序列，并且进一步包括1、2或3个额外的氨基酸变化并保持耐热性。在所有此类情况和实施方案中，变体保持耐热性，在高达80℃、高达85℃、高达90℃、高达93℃、高达95℃处理或孵育至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、高达10分钟、高达15分钟、高达20分钟后，保持与耐热突变酶seq id no:1没有显著差异的磷酸酶活性。

65、在实施方案中，提供了一种组合物，其包含本文所述的一种或多种突变碱性磷酸酶多肽以及添加剂或稀释剂或载体。

66、在一些实施方案中，所述组合物进一步包含抗炎剂、分子或细胞因子。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含抗菌剂和/或抗感染剂。抗菌剂可以包括抗生素。抗感染剂可以包括疫苗或抗原。

67、本发明提供了用于改善动物健康的酶、组合物和方法。酶、组合物和方法改善动物的健康，包括减少肠道中的细菌脂多糖(lps)，减少炎症特别是细菌介导的炎症，减少促炎细胞因子的产生，特别是在肠道中，改善肠道通透性标志物，改善性能参数，以及改善或导致动物更有效的营养利用。在一些实施方案中，所述酶、组合物和方法减轻慢性饮酒、肠道渗漏、肠道通透性增加和炎症的影响，并治疗或预防与酒精相关的肠道微生态失调、肠道渗漏和肠道通透性增加及炎症。

68、在一个实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种突变耐热碱性磷酸酶的组合物，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强了动物健康。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其具有seq id no:1、2、3或18-73的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强动物健康。在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其具有seq id no:1、2、3、7、8、12、15或18-73所示的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强动物健康。

69、在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其具有seq id no:1、2、3或18-73的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，其中所述组合物增强动物健康，包括减少肠道中的细菌脂多糖(lps)，减少炎症特别是细菌介导的炎症，减少促炎细胞因子的产生，特别是在肠道中，改善肠道通透性标志物，改善性能参数，以及与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，改善或导致动物中更有效的营养利用。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其具有seq id no:1、2、3或18-73的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强动物健康，包括减轻慢性饮酒、肠道渗漏、肠通透性增加和炎症的影响。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含seq id no:1的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强动物健康，包括减轻慢性饮酒、肠道渗漏、肠通透性增加和炎症的影响。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含seq id no:2的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强动物健康，包括减轻慢性饮酒、肠道渗漏、肠通透性增加和炎症的影响。在一个实施方案中，本发明提供了包含seq id no:1的突变耐热碱性磷酸酶的组合物，其中与未施用所述组合物的动物相比，当向动物施用有效量时，所述组合物增强动物健康，包括减轻慢性饮酒、肠道渗漏、肠通透性增加和炎症的影响。

70、本公开提供了减少肠道中细菌脂多糖(lps)、减少炎症特别是细菌介导的炎症、减少促炎细胞因子的产生(特别是在肠道中)、改善肠道通透性标志物、改善性能参数以及改善或导致动物中更有效的营养利用的方法，所有和任何方法都包括施用有效量的至少一种如本文所述的突变耐热碱性磷酸酶。本发明提供了减少肠道通透性、减轻酒精诱导的或与疾病相关的肠漏综合征、减轻慢性饮酒的肠道和全身影响(包括肠道微生态失调)以及减少炎症(包括肠道衍生的或肠道相关的炎症)的方法，所有和任何方法都包括施用有效量的至少一种如本文所述的突变耐热碱性磷酸酶。在所述方法的实施方案中，施用seq id no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。在所述方法的实施方案中，施用seq id no:2的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体。在所述方法的实施方案中，施用seq id no:1的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体。在所述方法的实施方案中，施用seq id no:1的突变体耐热碱性磷酸酶。

71、在一个实施方案中，本公开提供了一种减少受试者肠道中细菌脂多糖(lps)的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种在受试者中减少炎症特别是细菌介导的炎症的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种减少促炎细胞因子产生的方法，特别是在受试者的肠道中。在一个实施方案中，本公开提供了一种改善受试者肠道通透性标志物的方法。在一个实施例中，本公开提供了一种改善受试者的性能参数的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种在受试者中提高营养利用率或提供更有效的营养利用率的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种减轻或调节受试者肠道通透性增加或肠道渗漏的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种降低受试者肠道通透性的方法。所述方法包括施用有效量的至少一种如本文所述的突变体耐热碱性磷酸酶。在所述方法的实施方案中，施用seqid no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。

72、在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的突变体耐热碱性磷酸酶中的至少一种，以及任选的抗炎剂、分子或细胞因子。在所述方法的实施方案中，向受试者施用seq id no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，并且任选地施用抗炎剂、分子或细胞因子。在所述方法的实施方案中，向受试者施用seq id no:2的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，并且任选地施用抗炎剂、分子或细胞因子。在所述方法的实施方案中，向受试者施用seqid no:1的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，并且任选地施用抗炎剂、分子或细胞因子。在所述方法的实施方案中，向受试者施用seq id no:1的突变体耐热碱性磷酸酶中的至少一种，并且任选地施用抗炎剂、分子或细胞因子。

73、在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的突变体耐热碱性磷酸酶和任选的抗菌剂和/或抗感染剂中的至少一种。在所述方法的实施方案中，向受试者施用seq id no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种，并且任选地施用抗菌剂和/或抗感染剂。

74、在一个实施方案中，本公开提供了一种在受试者中减少炎症的方法，包括肠源性或肠相关炎症，包括与细菌lps、肠道疾病或肠道细菌感染相关的炎症。所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物具有seq id no:1、2、3或18-73的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物具有seq id no:2的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物具有seq id no:1的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用一种或多种seq id no:1、2或3的酶或组合物，所述组合物包含seq id no:1、2或3的突变体耐热碱性磷酸酶和任选的抗炎剂、分子或细胞因子中的至少一种。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用组合物一种或多种seq idno:1、2、3或18-73的酶或组合物，所述组合物包含seq id no:1、2、3-或18-73突变的耐热碱性磷酸酶中的至少一种，以及任选的抗炎剂、分子或细胞因子。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用一种或多种seq id no:2的酶或包含seq id no:2的突变体耐热碱性磷酸酶和任选的抗炎剂、分子或细胞因子的组合物。在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用一种或多种seq id no:1的酶或包含seq id no:1的突变耐热碱性磷酸酶的组合物，以及任选的抗炎剂、分子或细胞因子。

75、在所述方法的一个实施方案中，施用seq id no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。在实施方案中，抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂与seq id no:1、2、3或18-73的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种组合施用。seq id no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种可以在一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂之前施用；可以在一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂之前并与其联合施用；可以在一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂之前、与之结合并在其之后施用；或者可以与一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂联合施用或在其之后不久施用。一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂可以单剂量或多剂量施用。seq id no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种可在一剂一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂或多剂一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子、免疫调节剂之前和/或之间和/或与之组合施用。

76、在另一个实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含本文提供的突变碱性磷酸酶多肽。在一个实施方案中，组合物进一步包含添加剂或稀释剂或载体，例如药学上可接受的载体或可消化的载体。在一个实施方案中，本发明包括抗炎或抗菌组合物，所述组合物包含本文提供的一种或多种突变碱性磷酸酶多肽和添加剂或稀释剂或载体，例如药学上可接受的载体或可消化的载体。在一个实施方案中，本发明包括饲料组合物或饲料添加剂，所述组合物包含本文提供的突变碱性磷酸酶多肽。

77、在一个实施方案中，本公开提供了一种减少受试者肠道或肠道炎症的方法，所述炎症包括细菌介导的炎症。在一个实施方案中，本公开提供了一种减少受试者肠道或肠道中促炎细胞因子产生的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种提高受试者营养利用率的方法。在一个实施方案中，本公开提供了增加受试者中碱性磷酸酶(ap)产生和活性的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种增加动物十二指肠、空肠和回肠中ap产生和活性的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种在受试者中，包括在受试的肠道中，减少tnfα表达的方法，特别是在lps存在的情况下。在一个实施方案中，本公开提供了一种减少受试者中(包括在受试者的肠道中)il-6表达的方法，特别是在lps存在的情况下。在一个实施方案中，本公开提供了一种在受试者中(包括在受试的肠中)促进无机磷酸盐从lps释放的方法。在一个实施方案中，本公开提供了一种改善受试者，特别是牲畜的生长和性能参数的方法。任何这样的方法包括向受试者或动物施用有效量的组合物，所述组合物包含seqid no:1、2、3或18-73的突变体耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。

78、所述方法包括进一步向受试者施用一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂。所述方法包括向受试者进一步施用一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂，包括在组合物中组合施用。

79、在一个实施方案中，本公开提供了一种减少与胃肠道疾病相关的肠道炎症的方法，所述胃肠道疾病包括或例如受试者的炎症性肠病(ibd)、克罗恩病或乳糜泻。所述方法包括向受试者或动物施用有效量的组合物，所述组合物包含seq id no:1、2、3或18-73的突变耐热碱性磷酸酶或其耐热变体中的至少一种。所述方法包括进一步向受试者施用一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂。所述方法包括向受试者进一步施用一种或多种抗炎剂、分子或细胞因子或免疫调节剂，包括在组合物中组合施用。

80、通过对以下具体实施方式的综述，本领域技术人员将清楚地看到其他目的和优点，该详细描述将参考以下说明性附图和随附的权利要求进行。