TNC高表达在食管鳞癌诊断和治疗中的应用

本发明涉及食管鳞癌的诊断和治疗的领域。具体地，本发明涉及tnc高表达在食管鳞癌检测和治疗中的应用。

背景技术：

1、食管鳞癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，食管鳞癌分子靶向药物的研究和应用远远落后于其它肿瘤，迄今尚无有效的靶向药推荐用于食管鳞癌的临床治疗。因此，鉴定食管鳞癌中异常改变的分子，阐明其作用机制，对于食管鳞癌标志物的鉴定及靶向抑制研究具有重要意义。

2、tenascins是一类大分子寡聚糖蛋白，参与组成细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)，其命名来源于这类蛋白在生理情况下仅表达于肌腱(tendons)和胚胎(embryos，拉丁语nasci)中。tenascins在胚胎中几乎广泛表达于各个组织器官中，而在健康成人体内，tenascins仅在与机械应力相关的少量肌腱组织、一些表皮细胞与干细胞中低水平表达。tenascins家族包括4类分子：tenascin-c(tnc),tenascin-r，(tnr),tenascin-x，(tnx)和tenascin-w，(tnw)，这4种蛋白在脊椎动物中保守度较高[参见，pmid:18761101]。每种tenascin蛋白n端均为被半胱氨酸残基围绕的7个重复序列，其后是一段egf-like重复序列和由mrna可变剪接导致的多种纤连蛋白iii型重复序列，c-端是纤维蛋白原相关结构域[pmid:12845616]。tenascins通过其n端的重复序列形成同源三聚体(tnr和tnx)或同源六聚体(tnc和tnw)。

3、tnc由30个外显子组成，2号与3号外显子参与编码tenascin-c蛋白n端；4号至23号外显子参与编码黏连蛋白样重复序列(fibronectin typeⅲdomain，fnⅲ)，其中有9个编码fnⅲ外显子能够被可变剪接；24至28号外显子参与编码c端的纤维蛋白原样结构域(fbgdomain)。tnc的转录起始位点位于第一个外显子。转录起始位点上游220bp范围内含有tatabox(-20到-26碱基)，具有启动子活性[pmid:7531707]。

4、tnc蛋白可大体分为3类结构域：①n端的信号肽段及egf样重复序列，②中段的fniii样结构域，③c端的fbg样结构域。

5、①n端结构域：tnc单体蛋白在分泌出胞外后，各单体蛋白的n端结构域依靠彼此分子内的疏水作用与二硫键相互作用，构成一个同型六聚复合物，参与构成细胞外基质。

6、②中段的fn iii样结构域：该段结构域具有广泛的可变剪接存在。在不同的器官类型中，其剪接异构体的排列存在显著差异，有多种蛋白通过该段结构域与tnc相互作用。

7、③c端的fbg样结构域：tnc的该段结构域能够与整合素相互作用，并激活tlr4信号通路，上调炎症因子的表达[pmid:19561617]。

技术实现思路

1、本发明人前期对20例食管鳞癌患者肿瘤组织及4例食管鳞状上皮正常组织标本进行转录组测序，发现tnc在食管鳞癌组织中显著高表达。tnc(tenascin c)是一种可分泌的大分子量糖蛋白，可定位于细胞质及细胞膜外。tnc在生理情况下仅于胚胎或人体肌腱、韧带等处低水平表达；而在病理情况下，tnc可于机体受到机械损伤、肌肉拉伤、自身免疫系统功能紊乱或肿瘤形成过程中高表达。在我们的测序结果中，tnc mrna在被测的4例正常食管上皮组织中均不表达，而在一些食管鳞癌组织中显著高表达。

2、本发明人首先利用原位检测技术，证实tnc的mrna和蛋白在食管鳞癌组织中均存在高表达。体外实验结果显示，敲降tnc可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖和集落形成，而过表达tnc则能够促进细胞的增殖；同时，敲降tnc后，诱导细胞发生凋亡以及g1期阻滞。体内实验结果表明，敲降tnc可降低食管鳞癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力。在分子水平，敲降tnc后，细胞内egfr磷酸化水平降低，同时pi3k蛋白及其下游的akt及mtor的磷酸化水平也降低，表明高表达的tnc在食管鳞癌细胞中增强了egfr及pi3k/akt/mtor信号通路的活性。我们进一步在食管鳞癌细胞中敲降tnc联合使用靶向egfr和pi3k-akt通路的抑制剂，发现对食管鳞癌细胞的增殖具有协同抑制效果，表明敲降tnc与egfr或pi3k通路抑制剂联合有可能作为食管鳞癌靶向治疗的一个重要候选途径。

3、基于上述结果，在第一方面，本发明提供了靶向tnc的试剂在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，其中所述靶向tnc的试剂是降低tnc基因和/或蛋白的表达水平的试剂。

4、在进一步的实施方案中，本发明提供了靶向tnc的试剂与egfr抑制剂或pi3k-akt-mtor-s6通路抑制剂组合在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，其中所述靶向tnc的试剂是降低tnc基因和/或蛋白的表达水平、和/或抑制tnc蛋白的功能的试剂。

5、在优选的实施方案中，所述靶向tnc的试剂与egfr抑制剂或pi3k-akt-mtor-s6通路抑制剂配制在同一药物中、或分开配制。

6、在本发明优选的实施方案中，降低tnc基因表达水平的试剂是核酸。

7、在本发明的另一方面，降低tnc基因表达水平的试剂选自与tnc基因序列互补的反义核酸分子，优选为tnc基因反向互补的单链rna分子，其可特异性结合和抑制内源性tnc基因。

8、在本发明优选的实施方案中，降低tnc蛋白表达水平是通过用干扰rna敲降tnc蛋白的表达水平。当在体内引入时，干扰rna与其他蛋白质形成rna诱导沉默复合物(“risc”)并启动称为rna干扰(rnai)的过程。在rnai过程中，risc合并单链干扰rna或双链干扰rna的一条链。并入的链充当risc识别互补的mrna转录物的模板。一旦确定互补mrna，risc中的蛋白质组分激活并切割mrna，导致靶基因表达的敲降。用于敲降靶基因表达的干扰rna分子的非限制性实例包括sirna、短发夹rna(shrna)、单链干扰rna和微rna(mirna)。使用这些干扰rna的方法是本领域技术人员公知的。

9、在本发明优选的实施方案中，敲降tnc蛋白表达水平的干扰rna选自sirna、shrna、单链干扰rna和微rna。

10、另一方面，本发明提供了靶向tnc的试剂在制备用于增强egfr抑制剂或pi3k-akt-mtor-s6通路抑制剂抗肿瘤效果的药物中的用途，其中所述靶向tnc的试剂是降低tnc基因和/或蛋白的表达水平、和/或抑制tnc蛋白的功能的试剂，具体地，所述肿瘤是食管鳞癌。

11、在本发明优选的实施方案中，egfr抑制剂选自达克替尼(dacomitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、poziotinib、培利替尼(pelitinib)、阿法替尼(afatinib)、来那替尼(neratinib)、奥斯替尼(osimertinib)和aee788。

12、在本发明优选的实施方案中，pi3k-akt-mtor-s6通路抑制剂选自pf-04691502、ly2584702、at13148和uprosertib。

13、在本发明的另一方面，提供了用于检测来自受试者样品的tnc表达水平的检测剂在制备用于诊断和/或预后食管鳞癌的试剂中的用途。

14、在优选的实施方案中，所述的tnc表达水平为tnc mrna表达水平，和/或tnc蛋白表达水平；

15、在本发明优选的实施方案中，检测tnc基因表达水平的检测剂包括但不限于特异性结合tnc基因的引物和/或探针。

16、可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测tnc mrna的表达水平，这样的方法包括但不限于：northern blot、聚合酶链式反应、逆转录酶pcr、定量实时pcr、纳米阵列、微阵列、放射自显影或原位杂交。

17、尤其是，可以用实时定量rt-pcr(qrt-pcr)。在一些实施方案中，qrt-pcr可以被用于对tnc mrna进行检测和定量。qrt-pcr是本领域技术人员熟知的且容易获得的技术，且不需要详细的说明。例如可以使用商品化可获得的基于qrt-pcr的方法(如阵列)，基于本领域公知的tnc的序列，很容易设计引物和/或探针。

18、在本发明优选的实施方案中，检测tnc蛋白表达水平的检测剂包括但不限于特异性结合tnc蛋白的抗体。

19、可以使用本领域技术人员公知的任何方法检测tnc蛋白的表达水平，这样的方法包括但不限于：western blot、免疫印迹、elisa、质谱法。

20、在本发明的一个实施方案中，所述的样品为食管鳞癌样品。

21、术语

22、除非本文有具体说明，否则本文中使用的术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

23、如本文中所述，egfr，也称为表皮生长因子受体，是一种跨膜蛋白，其分为三部分：蛋白的一端位于细胞外，一部分位于细胞膜，另一端则位于细胞内。这允许egfr受体与细胞外的其他蛋白(称为配体)结合，帮助细胞接收信号并对其环境作出反应。当egfr与配体结合时，它会附着于另一个位于附近的egfr受体并形成复合物(二聚体)，从而进入激活状态，并激活细胞内的信号传导途径。

24、如本文所用的术语“egfr抑制剂”或“egfr靶向剂”在本文意图与其在本领域的一般含义一致。更特别地，“egfr抑制剂”或“egfr靶向剂”在本文意图作为通过egfr抑制信号传导的产品(例如，化合物、分子、复合物、组合物)。

25、如本文所用的术语“egfr抑制剂”或“egfr靶向剂”包括但不限于达克替尼(dacomitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、poziotinib、培利替尼(pelitinib)、阿法替尼(afatinib)、来那替尼(neratinib)、奥斯替尼(osimertinib)和aee788。

26、如本文所用的术语“pi3k-akt-mtor-s6通路抑制剂”或“pi3k-akt-mtor-s6通路靶向剂”是指通过pi3k-akt-mtor-s6通过抑制信号传导的产品(例如，化合物、分子、复合物、组合物)，包括但不限于pf-04691502、ly2584702、at13148和uprosertib。

27、如本文所述的“样品”，可以为源自食管鳞癌患者的任何生物样品，其中包含核酸和/蛋白质。这种样品的实例包含液体(包含血液、血浆、血清、尿液、精液)、组织、细胞样品、器官、活检样品、肿瘤样品等。优选地，样品为组织、细胞的活检样品；更优选地，样品为活检的食管鳞癌组织样品。样品可以根据常规的技术进行收集，并直接用于诊断或贮存。肿瘤样品可以是新鲜的、冷冻的或者石蜡包埋的。通常地，可用的肿瘤样品是冷冻的或者石蜡包埋的，大多数时候是石蜡包埋的。

28、如本文所述的“参考样品”，可以为源自对照的样品，所述对照为健康受试者或者可以为已知具有或不具有淋巴结转移的食管鳞癌患者，所述参考样品包括但不限于，包含液体(包含血液、血浆、血清、尿液、精液)、组织、细胞样品、器官、活检样品、肿瘤样品等。优选地，样品为组织、细胞的活检样品，更优选地，样品为活检的食管鳞癌组织样品。优选地，参考样品池包含源自至少一名(优选地为数名，更优选地为至少5名，更优选地至少6名，至少7名，至少8名，至少9名，至少10名)对照的样品。

29、本文中所用的术语“引物”指的是与模板杂交并用于引发与目标互补的多核苷酸的聚合的短多核苷酸，通常具有游离的3’oh基团。

30、本文中所用的术语“探针”指的是在基于杂交的试验中，用于检测与探针互补的多核苷酸序列的短多核苷酸，探针可以由在此限定的多核苷酸的“片段”组成。

31、本文中的术语“抗体”按最广义使用，指包含两个重链和两个轻链的任何免疫球蛋白(ig)分子，以及其任何片段、突变体、变体或衍生物，只要该片段、突变体、变体或衍生物表现出所需要的生物学活性(例如，表位结合活性)。

32、如本文所用，“降低”tnc的表达水平，指与施用所述“降低”试剂之前的参考水平相比，tnc表达水平降低至少10％，例如降低至少约10％，或至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或多至且包括100％的降低(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低；优选地，所述参考水平，可以指施用本发明的试剂治疗前的水平。

33、术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。

34、如本文所用，术语“敲降”是指与不包含减少表达的遗传修饰的对应对照细胞中靶mrna或相应蛋白质的表达相比，遗传修饰细胞中靶mrna或相应蛋白质表达的可测量的降低。本领域技术人员将容易理解如何使用各种遗传方法，例如sirna、shrna、mirna、反义rna或其他rna介导的抑制技术，以基于本文所述细节敲降靶多核苷酸序列或其部分。

35、术语“干扰rna”是指rna核酸分子，其是双链或单链的，并且能够实现针对敲降靶基因表达的rna干扰机制的诱导。

36、如本文所用的术语，“sirna”是双链rna，其长度通常小于30个核苷酸。通过sirna的基因沉默开始于sirna的一条链并入称为rna诱导沉默复合物(risc)的核糖核蛋白复合物中。并入risc中的链识别与并入的sirna链至少部分互补的mrna分子，且然后risc切割这些靶mrna或抑制其翻译。

37、术语“mirna”是小的非编码rna分子，其可以与mrna分子内的互补序列杂交，从而导致mrna的切割，或通过缩短其聚(a)尾巴使mrna不稳定。

38、术语“单链干扰rna”可以与双链sirna类似的方式实现mrna沉默，尽管效率低于双链sirna。单链干扰rna通常具有约19至约49个核苷酸的长度。

39、术语“短发夹rna或小发夹rna(shrna)”是具有紧密发夹转角的人工rna分子，其可用于通过其在细胞中产生的sirna沉默靶基因表达。shrna在细胞中的表达通常通过质粒载体或通过病毒或细菌载体实现。合适的载体包括但不限于腺相关病毒(aav)、腺病毒和慢病毒。shrna是sirna的有利介质，因为它具有相对低的降解和转换率。

40、术语“拮抗剂抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括抑制或降低该抗体所结合的抗原(例如，tnc)的生物活性的抗体。因此，tnc拮抗剂抗体涵盖结合tnc并且以任何有意义的程度(包括显著地)阻断、抑制、抵消、拮抗、降低tnc激动剂活性的抗体。

41、术语“小分子抑制剂”在最广泛的意义上使用，并且包括抑制或降低该抑制剂的靶分子(例如，tnc)的生物学功能或活性的小分子化合物。因此，tnc的小分子抑制剂涵盖结合tnc并且以任何有意义的程度(包括显著地)阻断、抑制、抵消、拮抗、降低tnc功能或活性的小分子化合物。

42、术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且无论是体外还是原位，是指可适用于本文所述的方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。

43、术语“治疗”或“处理”包括在受试者如人中治疗本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发生；(ii)缓解疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。

44、术语“施用”或“给予”治疗剂如降低tnc表达的试剂包括引入或递送治疗剂以执行预期功能的任何途径。可以通过适合于递送药剂的任何途径进行施用。因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。在一些实施方案中降低tnc表达的试剂直接施用于肿瘤，例如，通过注射到肿瘤中。

45、以下将结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的实施方案，但是，不应理解为将本发明的范围限于这些具体实施例。