一种复合脂质体佐剂及其制备方法与流程

本技术属于生物医药工程领域，特别涉及一种复合脂质体佐剂及其制备方法。

背景技术：

1、铝佐剂作为唯一注册佐剂在世界范围广泛应用，其主要介导体液免疫，对于以细胞免疫为主的疾病却效果不佳。

2、″脂质体″是封闭的小囊泡结构，由一个或多个脂质双层体围绕着水性核心而构成。每个脂质双层体由两个脂质单层体组成，其中每个单层体有一个疏水的“尾部”区域和一个亲水的“头部”区域。在双层体中，脂质单层体的疏水“尾部”指向双层体内部，亲水“头部”朝向双层体外部。脂质体可具有多种物理化学性质，例如大小、脂质组成、表面电荷、流动性、双分子膜的数量。根据脂质双层体的数量，脂质体可归类为单层小囊泡(uv)或者多层小囊泡(mlv)，单层小囊泡是由单一脂质双层体构成，多层小囊泡是由两个或多个同心的双层体构成且双层体彼此被水层间隔分离。水溶性化合物被捕获入脂质体的水相/核，相反的，亲脂性化合物被捕获入脂质双层膜的核心。

3、阳离子脂质体作为疫苗佐剂被发现已经超过40年，不仅具有抗原提呈、保护抗原防止其在体内降解的作用，而且能诱导树突状细胞成熟，增强免疫反应。其表面正电荷是延长疫苗在注射部位停留、增加抗原提呈、延长刺激体内细胞免疫时间的重要因素。但如果细胞摄入大量的阳离子脂质，将对细胞产生较大的毒性作用，引起细胞凋亡或坏死，其是否会在细胞内积累，目前尚不十分明确需要更深入的研究[生命的化学，2016，36(1)：50-56]。

4、polyi:c是合成的双链rna，能诱导产生抗原特异性的cd8+t细胞，可被内含体的tlr3受体识别。授权公告号为cn102247595b的发明专利中公开了将dda和polyi:c联合应用作为结核亚单位疫苗佐剂使用，在加强bcg免疫后，能有效诱导小鼠特异性的细胞免疫应答，且能有效的减轻结核分枝杆菌感染造成的病理损伤。然而后续试验显示，该佐剂稳定性较差、易于发生絮凝现象，不利于最终投入生产和实际应用。为此，我们在前人研究的基础上，研究更加稳定和有效的新型免疫佐剂，以增强疫苗的保护效果，适于后期的研发和生产。

技术实现思路

1、本发明公开一种稳定的、免疫效果突出的复合脂质体佐剂，不仅包括中性脂质还包括阳离子脂质。虽然其毒性高于中性脂质，但是发明人发现在合适的配比下所形成的复合脂质体佐剂由于细胞膜负电而更易于进入细胞内，同时激活不同的信号通路，从而发挥协同作用，高质量的免疫组合物不仅有强大的免疫刺激性，同时具有更高的稳定性，具有深入研究和推广应用的潜力。

2、本发明第一方面提供一种复合脂质体佐剂，其主要成分包括：

3、a)由dopc和dotap组合的脂质混合物；

4、b)胆固醇；

5、c)3d-mpl与polyi:c，

6、其中dopc与dotap的重量比为1～9:1，例如4:1、6:1或9:1，最优选为9:1；脂质混合物与胆固醇的重量比是4:1，固醇与3d-mpl的重量比是5:1，mpl与polyi:c的重量比为1:0.2～1:30，具体可以为1:0.2、1:0.5、1:1、1:2、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25或1:30。

7、在一个优选的实施例中，3d-mpl与polyi:c的重量比为1:1～1:10，例如1:1、1:2、1:5或1:10。

8、优选地，在终浓度的所述复合脂质体佐剂中，polyi:c的浓度为0.1～3mg/ml，进一步优选为0.1～1mg/ml，例如0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml。

9、本发明第二方面提供复合脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：

10、1)制备有机相和水相：将包含dopc/dotap的脂质混合物、胆固醇和3d-mpl按质量比90～100:20～30:4～5的比例溶解于有机溶剂中，得到有机相备用；制备注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液，作为水相备用；

11、2)制备脂质体溶液：用微流控装置将所述有机相和所述水相混合，去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液；

12、3)制备佐剂原液：用所述水相溶解polyi:c、并与脂质体溶液混合，得到复合脂质体佐剂。

13、在一些实施例中，步骤3)可以用如下方法替代：

14、制备脂质体溶液：将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜；在脂质薄膜中加入水相溶液进行水化，再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液，进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。

15、在一些实施例中，所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺(dmf)、甲醇、丙酮、二甲基亚砜(dmso)、乙醇、正丙醇、异丙醇、氯仿或其中两者的混合物，例如乙醇/异丙醇混合溶剂。

16、在一个优选的实施例中，步骤3)制备脂质体溶液可以经过1-2次过滤得到最终的脂质体佐剂。通过透析除去溶剂，稀释后提供终浓度的脂质体佐剂。

17、在一些实施例中，步骤3)中微流控过程在20-25℃温度下以总流速4-6ml/min和有机相:水相＝1:3-1:6的流速比运行。例如在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相＝1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相＝1:4的流速比运行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相＝1:5的流速比运行等。

18、本发明第三方面提供疫苗组合物，包括本发明制备的复合脂质体佐剂和抗原类成分。

19、在一些实施例中，抗原类成分可以来源于人乳头瘤病毒(hpv)、引发手足口病的肠道病毒、结核分枝杆菌、单纯疱疹病毒(hsv)、巨细胞病毒(cmv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、新型冠状病毒(sars-cov-2)、肝炎病毒和狂犬病毒中的至少一种。

20、本发明第四方面提供包含复合脂质体佐剂的疫苗组合物的制备方法，步骤包括：

21、1)制备有机相和水相：将包含dopc/dotap的脂质混合物、胆固醇和3d-mpl按质量比90-100:20-30:4-5的比例溶解于有机溶剂中，得到有机相备用；用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解抗原类成分，作为水相备用；

22、2)制备脂质体溶液：用微流控装置混合有机相和水相，去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液。

23、3)制备疫苗组合物：用注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液溶解polyi:c、并与脂质体溶液混合，得到疫苗组合物溶液。

24、在一些实施例中，步骤3)可以用如下步骤替代：

25、制备脂质体：将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜；在脂质薄膜中加入水相进行水化，再经过微射流均质获得浓缩脂质体原液，进一步稀释成所需要浓度的脂质体溶液。

26、在一些实施例中，所述有机溶剂选自乙腈、二甲基甲酰胺(dmf)、甲醇、丙酮、二甲基亚砜(dmso)、乙醇、正丙醇、异丙醇或其中两者的混合物，例如乙醇/异丙醇混合溶剂。

27、在一个优选的实施例中，步骤3)制备脂质体溶液可以经过1-2次过滤得到最终的脂质体佐剂。通过透析除去溶剂，稀释提供终浓度的脂质体佐剂。

28、在一些实施例中，步骤3)中微流控过程在20-25℃温度下以总流速4-6ml/min和有机相:水相＝1:3-1:6的流速比运行。例如在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相＝1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相＝1:4的流速比运行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相＝1:5的流速比运行等。

29、在一些实施方式中，所述抗原类成分来源于人乳头瘤病毒(hpv)、引发手足口病的肠道病毒、结核分枝杆菌、单纯疱疹病毒(hsv)、巨细胞病毒(cmv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、新型冠状病毒(sars-cov-2)、肝炎病毒和狂犬病毒中的至少一种，所述的抗原类物质在一些实施例中优选重组蛋白类形式的抗原。

30、在一个优选的实施例中，本发明的复合脂质体佐剂中选用的阳离子脂质为dotap(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)。dotap与中性脂质(例如dopc)的组合稳定性上优于dopc与dda的脂质组合。主要优点是dotap与中性脂质例如dopc的组合更稳定，制成的脂质体混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月，相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3-5倍，特别是当dopc与dotap的比例达到9:1时，溶液更加澄清、稳定性更好。另外，dopc与dda的脂质组合获得的脂质体粒径大于200nm，对工艺后期的过滤除菌等会有不利影响，而本发明的复合脂质体佐剂可以获得粒径在100-200nm之间的脂质体颗粒，有利于后期工艺及免疫增效。

31、本发明的复合脂质体佐剂中含有两种免疫刺激剂，分别为tlr3激动剂polyi:c和tlr4激动剂3d-mpl。polyi:c吸附在脂质的外层，免疫效果更突出，粒径大小和均一度更优，与3d-mpl联合使用可以同时激活两种tlr信号通路，更高效地激活先天免疫系统。另一方面，存在于脂质层的mpl，与吸附在脂质外层的polyi:c，两层存在位置差，以特定比例组合的3d-mpl和polyi:c能够在不同信号通路中更好地发挥联合作用，使得免疫效果更持久。

32、本发明的抗原类成分溶于复合脂质体佐剂的内水相中，免疫效果优于脂质体溶液复溶后加入抗原、或者直接将脂质体溶液与抗原溶液混合。