基于Cas13的非核酸扩增检测RNA的方法、试剂盒和应用

本发明涉及生物，尤其是涉及一种基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法、试剂盒和应用。

背景技术：

1、如下陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

2、目前针对rna的检测，主要利用逆转录实时荧光定量pcr，rna在逆转录酶的作用下转变为cdna，之后再利用实时荧光定量pcr对cdna进行检测，其需要反复变性退火等过程，操作繁琐、耗时长。也有一些基于等温扩增rna检测方法，如expar，nasba等；但基于核酸扩增的信号放大策略体系复杂，耗时较长，且产生的核酸扩增产物容易造成气溶胶污染。

3、现有基于链置换反应构成的dna级联放大对rna的检测，由于链置换反应自身的限制，检测靶标只能是短序列rna；且基于链置换反应构成的dna级联放大对检测信号输出大部分通过在链置换反应中某一茎环结构或双链dna组分进行荧光基团或其他修饰，制备复杂且不易保存，容易产生假阳性结果。

4、然而，不论所使用的方法以及尽管做了技术改进，由目前对rna检测的方法通常在其应用时有许多缺点，特别是：（1）逆转录加实时荧光定量pcr需要两管操作，容易造成rna降解；（2）需要专用且精密的控温仪器；（3）耗时长，不利于快速检测；（4）扩增的核酸容易造成气溶胶污染，难以消除污染的影响；（5）基于链置换反应的dna级联放大只能检测短序列rna；（6）基于链置换反应的信号放大策略，利用反应中某一茎环或双链dna组分标记荧光基团或标记其他产生信号物质，制作复杂且不易保存。

5、上述缺点是由于以下原因造成的：（1）以pcr为基础的扩增方法无法直接扩增rna，需要逆转录，需要进行往复升温与降温的pcr扩增反应。（2）以恒温扩增为基础的扩增方法，耗时长，易产生核酸扩增产物气溶胶污染。（3）链置换反应只能检测短序列rna。（4）dna级联放大信号反应对信号的输出形式往往比较复杂，难以操作。因此，如何改进rna的检测方法是目前亟待解决的问题。

6、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法，以改进现有技术中rna检测的缺陷，基于该方法，本发明的目的还在于提供一种用于rna检测的试剂盒和它们的应用。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、第一方面，提供了一种基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法，该方法的反应体系包括cas13蛋白、crrna、茎环dna、ds1、ds2、燃料链、rna报告分子和金属离子；

4、所述crrna靶向目标rna；

5、所述茎环dna由单链dna折叠构成，所述茎环dna一侧的环结构靠近茎结构位置存在至少两个尿嘧啶核糖核苷酸；尿嘧啶核糖核苷酸将所述茎环dna分隔为茎环单链a和茎环单链b两部分；

6、ds1为双链dna，由互补的ds1-t和ds1-b通过互补配对构成，所述ds1存在由ds1-t构成的单链dna段ds1a，所述茎环单链b与所述单链dna段ds1a至少部分互补配对；

7、燃料链为单链dna，所述燃料链与所述ds1-t的部分互补配对；部分互补配对位置不位于所述单链dna段ds1a，所述部分互补配对位置的dna不与所述茎环单链b结合；

8、ds2为双链dna，由互补的dnazyme和blocker通过互补配对构成，所述ds2存在由blocker构成的单链dna段ds2a，所述ds1-b与所述单链dna段ds2a至少部分互补配对；

9、所述rna报告分子为单链rna，修饰有发光基团和淬灭基团；

10、所述dnazyme的结合臂与所述rna报告分子互补配对；

11、所述检测方法包括：当目的rna存在时，cas13蛋白在crrna的引导下与目的rna结合，切割所述反应体系中茎环dna使所述茎环dna分隔为茎环单链a和茎环单链b两部分；所述茎环单链b与所述ds1发生链置换反应，得到单链dna状态的ds1-b和由茎环单链b和ds1-t结合的中间体id；

12、所述燃料链与所述中间体id发生链置换反应，得到单链dna状态的茎环单链b，所得到单链dna状态的茎环单链b，并在所述燃料链存在下不断与ds1发生链置换反应；

13、所述单链dna状态的ds1-b和所述ds2发生链置换反应，得到单链dna状态的dnazyme，dnazyme在金属离子存在时切割所述rna报告分子，使所述反应体系中释放荧光信号。

14、第二方面，提供了一种用于rna检测的试剂盒，该试剂盒包括用于组成第一方面中所述的反应体系的试剂。

15、第三方面，提供了第一方面所述的基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法，或第二方面所述的试剂盒在非诊断和治疗目的地检测病原微生物，或制备用于检测病原微生物的产品中的应用。

16、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

17、本发明提供的基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法利用cas13蛋白可以识别检测rna，引发dna回路的级联放大反应对检测信号进行放大，dnazyme对信号进行输出。

18、该方法无需对待检测的rna靶标进行核酸预扩增，可直接检测rna。利用茎环结构释放引发dna级联放大信号的靶标。利用dna链之间的链置换反应构成dna级联放大的信号循环放大系统从而释放大量的dnazyme。利用dnazyme在金属离子存在时对rna底物的切割特性，对rna底物进行荧光标记，进行结果输出。

19、本发明提供的检测方法可实现在单一容器中反应且全程恒温。反应可以在室温至42度的温度下进行，但优选在大致37度进行。在优选的方案中可以在约10分钟内观察到阳性结果与阴性结果的明显差异。

20、本发明提供的检测rna的方法或基于该方法的试剂盒可应用于检测病原微生物，或制备用于检测病原微生物的产品，具有检测快速，检测条件简单，无需复杂精密设备的优势。

技术特征：

1.一种基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法，其特征在于，反应体系包括cas13蛋白、crrna、茎环dna、ds1、ds2、燃料链、rna报告分子和金属离子；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，尿嘧啶核糖核苷酸远离茎结构的一侧为所述茎环单链b。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ds1a和所述ds2a的长度分别独立的至少为2bp。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属离子包括mg2+、na+、k+、pb2+、mn2+、hg2+、cd2+、cu2+、uo22+和ca2+中的至少一种。

5. 根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，茎环单链b的核苷酸序列如seqdi no.3所示，ds1-t的核苷酸序列如seq di no.4所示，ds1-b的核苷酸序列如seq di no.5所示，燃料链的核苷酸序列如seq di no.6所示，blocker的核苷酸序列如seq di no.7所示，dnazyme的核苷酸序列如seq di no.8所示，rna报告分子的核苷酸序列如seq di no.9所示；

6. 根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系包括：cas13蛋白10~200 nm、crrna 200~300 nm、茎环dna 100~1000 nm、ds1 100~500 nm、ds2 50~500 nm、燃料链 10~200 nm、rna报告分子 100~1000 nm、金属离子1~200 mm和rnase抑制剂100 u/ml~5000 u/ml。

7.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，反应条件包括反应温度25~42℃，反应时间5~30min。

8.用于rna检测的试剂盒，其特征在于，包括用于组成权利要求1~7中任一项所述反应体系的试剂。

9.权利要求1~7任一项所述的基于cas13的非核酸扩增检测rna的方法，或权利要求8所述的试剂盒在非诊断和治疗目的地检测病原微生物，或制备用于检测病原微生物的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病原微生物包括淋病奈瑟菌和/或沙眼衣原体。

技术总结本发明提供了一种基于Cas13的非核酸扩增检测RNA的方法、试剂盒和应用，涉及生物技术领域。该方法的反应体系包括Cas13蛋白、crRNA、茎环DNA、DS1、DS2、燃料链、RNA报告分子和金属离子。当存在目的RNA时，Cas13蛋白切割茎环DNA释放能够置换出DS1中DS1‑b的茎环单链B，DS1‑b进一步置换出DS2中的能够切割RNA报告分子的DNAzyme，同时燃料链置换出中间体ID中的茎环单链B使其继续参加反应，达到放大信号的目的。该检测方法具有检测快速，检测条件简单，无需复杂精密设备的优势。技术研发人员：郑和平,尹笑纳受保护的技术使用者：南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心）技术研发日：技术公布日：2024/9/12