从发酵液制备含氨基酸产品的方法与流程

【】本技术涉及一种氨基酸颗粒的制备方法，其包括从发酵液除去细胞。【背景艺术】作为生产进料用氨基酸颗粒的方法之一，采用利用微生物的发酵方法，并且可通过直接干燥和固化微生物发酵液来生产氨基酸颗粒。特别地，已知一种用于低溶解度混合氨基酸的颗粒化的方法(us2021-0094903a1)。当从发酵液制备氨基酸颗粒时，在发酵液生产过程中使用的菌株(细胞)可残留在发酵液中。当细胞包含在氨基酸颗粒中时，存在产品注册过程变得复杂，并且很难在有转基因菌株问题的国家销售该产品的问题。此外，在颗粒的情况下，存在很难生产出纯度高于发酵液的产品的问题，但是通过除去细胞，可生产出含量高于传统颗粒的产品。【现有技术文献】【专利文献】(专利文献1)美国申请公开号2021-0094903a1(专利文献2)美国专利号8465962b2(专利文献3)美国专利号9885093b2(专利文献4)美国专利号10351859b2(专利文献5)美国专利号7863435b2(专利文献6)美国专利号10787692b2(专利文献7)美国专利号9029105b2(专利文献8)美国申请公开号2021-0094903a1

背景技术：

技术实现思路

0、【发明概述】

1、【技术问题】

2、本技术的一个目的是提供一种制备颗粒产品的方法，该颗粒产品由于细胞的除去，与传统的颗粒产品相比具有更少的gm菌株问题，与常规发酵肉汤相比具有高氨基酸含量，并且依粒径的含量均匀。

3、此外，本技术的另一个目的是提供一种氨基酸颗粒，与由于细胞的除去，与常规颗粒产品相比具有较少的转基因菌株问题，与常规发酵液相比具有高氨基酸含量。

4、【技术方案】

5、下面将对本技术进行详细说明。同时，本公开中公开的每一描述和实施例也可应用于其它描述和实施例。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都属于本技术的范围。此外，本技术的范围不受以下具体描述的限制。

6、此外，在本说明书中引用了许多论文和专利文献参考。所引用的论文和专利文献参考文献的内容全部通过引用并入本文，对本发明所属的技术领域的水平和本发明的内容将有更清晰的描述。

7、为了实现上述目的，本技术的一个方面提供一种氨基酸颗粒的制备方法，其包括：第一步，通过从含氨基酸的发酵液除去细胞来制备发酵滤液；及第二步，从发酵滤液形成颗粒。

8、本技术的制备方法通过在制备氨基酸颗粒的过程中除去细胞简化了产品注册过程，并且可提前对应存在转基因(gm)问题的国家。此外，在颗粒的情况下，存在很难生产出纯度高于发酵液的产品的问题，但有可通过除去细胞来生产出比传统颗粒含量更高的产品的优点。因此，通过使用本技术的制备方法可使产品纯度多样化。

9、本文所用的术语“氨基酸颗粒”是指含有颗粒形式氨基酸的混合物。然而，如果需要，只要不改变本技术的本发明的精神，氨基酸颗粒的剂型就可改变。此外，如上所述，可进一步执行后续过程以实现各种氨基酸颗粒的制剂。上述氨基酸颗粒可作为动物饲料等的添加剂，其用途不限。

10、在下文中，将详细描述根据本技术的一个方面制备氨基酸颗粒的方法的每个步骤。

11、首先，执行通过从含氨基酸的发酵液除去细胞来制备发酵滤液的第一步(s100)。

12、如本文所用，术语“除去细胞”不限于在溶液或产品中根本不包含细胞。具体来说，从溶液或产物中除去细胞意味着将用于制备氨基酸发酵液的菌株从溶液或产物中分离出来，直至其质量可忽略不计。因此，在分析发酵滤液(除去细胞的发酵液)或从其制备的氨基酸颗粒的质量及产物的组成时，可忽略细胞所占的质量。

13、第一步发酵液中所含的氨基酸可为l-氨基酸，并且特别地，该氨基酸可为溶解度低的氨基酸。例如，可应用于本技术的制备方法的氨基酸可为在25℃水中的溶解度大于0g/100g且小于或等于20g/100g的低溶解度的氨基酸，但不限于此。如上所述，通过应用低溶解度的氨基酸，可与现有工序相比，预期获得更显着的效果。

14、具体地，所述氨基酸可为缬氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸或苯丙氨酸，但不限于此。

15、第一步发酵液中所含氨基酸可通过提取法、合成法、发酵法、酶法等法制备。在某些情况下，氨基酸可来自通过使用微生物的发酵方法制备的发酵产物。本文所用的术语“发酵产物”或“发酵液”是指利用微生物通过酶促或代谢合成或降解有机材料的产物。例如，可包括含有通过在培养基中培养微生物而获得的微生物的培养物本身，或通过从中除去微生物而获得的培养物的浓缩物、干燥产品或冻干产品。在这种情况下，氨基酸混合物溶液可包括l-氨基酸和整个发酵产物，或者可为从发酵产物中除去杂质的。在本技术中，含氨基酸的发酵液可为通过已知的发酵方法(us 8465962 b2、us 9885093b2、us10351859 b2、us7863435 b2、us10787692 b2、us 9029105b2和us2021-0094903 a1)收获的发酵产物的液体，但不限于此。

16、本技术的“含氨基酸的发酵液”可与“含氨基酸的发酵液”或“氨基酸发酵液”互换使用。

17、在第一步中为了提供氨基酸而制备的发酵液可通过培养产生l-氨基酸的微生物而获得的产物。此时，如本文所用，术语“产生l-氨基酸的微生物”既包括野生型微生物，也包括自然或人工发生基因修饰的微生物，并且可为包括用于生产所需蛋白质或产物的基因修饰的微生物(随着外部基因的插入或内源性基因的活性增强或失活而特定机制减弱或增强的微生物)等。

18、第一步中使用的上述微生物可选自短杆菌属(brevibacterium)、棒杆菌属(corynebacterium)、埃希氏菌属(escherichia)、沙雷氏菌属(serratia)、欧文氏菌属(erwinia)、肠杆菌属(enterobacteria)、链霉菌属(streptomyces)或假单胞菌属(pseudomonas)等的微生物中的至少一种，或其人工突变体。因此，第一步可进一步包括使用上述至少一种微生物制备氨基酸混合溶液的步骤。

19、在可用于第一步的本技术的上述微生物中，“棒杆菌属(corynebacterium)微生物”可包括所有棒杆菌属(corynebacterium)的微生物。具体地，可为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、粗乳棒杆菌(corynebacteriumcrudilactis)、沙漠棒杆菌(corynebacterium deserti)、高效棒杆菌(corynebacterium efficiens)、美棒杆菌(corynebacterium cal lunae)、静止棒杆菌(corynebacterium stationis)、奇异棒杆菌(corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、污染棒杆菌(corynebacterium pollutisoli)、模仿棒杆菌(corynebacterium imitans)、睾丸棒杆菌(corynebacterium testudinoris)或微黄棒杆菌(corynebacterium flavescens)，以及更具体地说是谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)，但不限于此。

20、棒杆菌属(corynebacterium)微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)，是广泛用于生产l-氨基酸和其他有用物质的革兰氏阳性微生物。为了生产l-氨基酸和其他有用物质，正在进行各种研究，以开发具有高效生产和发酵过程技术的微生物。例如，在棒杆菌属(corynebacterium)微生物中，主要使用物质特异性方法，例如增加编码参与l-色氨酸、l-缬氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-组氨酸或l-苏氨酸等生物合成的酶的基因的表达，或除去对生物合成不必要的基因。

21、在第一步中，如上所述，从制备的发酵液除去细胞。如上所述，除去细胞并不一定是指从发酵液中完全除去细胞以使发酵液无菌。为了除去细胞，可采用离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、提取、超声破碎、超滤、透析、各种色谱法如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等、高效液相色谱法或其组合。除了上述方法外，还可使用本领域已知的适当方法从发酵液中分离细胞。

22、在第一步中，在某些情况下，可在分离细胞之前进行从发酵液中分离氨基酸晶体或使发酵液中的氨基酸晶体溶解的步骤。氨基酸晶体是指当发酵液中含有溶解度相对较低的高浓度氨基酸时，一些氨基酸在发酵液中结晶。当溶液中含有氨基酸晶体时，人们担心氨基酸晶体也可能在细胞除去过程中被除去。氨基酸晶体可通过溶解在发酵液中，或者在细胞除去之前单独分离它们进行回收，从而可防止发酵过程中产生的氨基酸被丢弃。

23、当在第一步从发酵液中分离出氨基酸晶体时，通过在第二步中回收分离的晶体可提高工序效率，并且可通过调整氨基酸晶体的剂量来控制氨基酸颗粒中的氨基酸含量(氨基酸纯度)。

24、在第一步中，当氨基酸晶体溶解在发酵液中时，可向发酵液中额外加入溶剂。当另外加入溶剂时，可加入溶剂以达到氨基酸的溶解度。此时，溶剂可为水(h2o)。

25、此外，第一步可包括添加钙源。具体地，可在第一步从发酵液中取出细胞之前或之后将钙源添加到发酵液中。

26、如本文所用，术语“钙”是脊椎动物的必需矿物质，因为它的功能是使骨骼健康并促进血液循环。超过99％的钙存在于骨骼和牙齿中，其余的存在于血液和肌肉中。足量的钙可维持骨骼健康并预防骨质疏松症。它还通过收缩肌肉来预防肌肉痉挛，并通过降低胆固醇水平来减少心血管疾病的发生。然而，当钙质不足时，骨骼不能正常形成，肌肉和神经会变得异常，因此即使有轻微的创伤，也很容易发生骨折等伤害，并且骨质疏松症的风险增加。钙可预防腹泻或痢疾，并且还以饲料添加剂的形式提供给动物(特别是仔猪)，以帮助消化和吸收。

27、本文所用的术语“钙源”是指能够提供(方式无限)钙离子(ca2+)的物质。钙源的实例可包括氢氧化钙(ca(oh)2)、氧化钙(cao)、碳酸钙(caco3)、硫酸钙(caso4)或氯化钙(cacl2)，但不限于此。

28、本文所用的术语“氢氧化钙(ca(oh)2)”是无色晶体或白色粉末形式的无机化合物。氢氧化钙在水中溶解时是碱性的，由于它价格低廉且毒性低，因此在本应用中可用作钙离子的来源。

29、本文所用的术语“氧化钙(cao)”是一种溶解在水中生成钙离子的物质，起着与氢氧化钙相同的作用。由于在水中溶解过程中的溶解热比较大，因此可以事先与水反应过的氢氧化钙浆料的形式提供到工序中。氧化钙到氢氧化钙的反应如下：cao+h2o→ca(oh)2。为了基于钙离子的等效摩尔比使用等量的氢氧化钙，可使将氢氧化钙乘以0.76(即氧化钙的分子量相对于氢氧化钙的分子量的比值)得到的量与水反应并加入。如上述反应式所示，氧化钙和水以1:1的摩尔比反应，因此，可通过从所需的氢氧化钙中减去添加的氧化钙来获得需要额外添加的水量，或者可添加更高的量，以便可使使用的所有氧化钙进行反应。

30、在第一步中，钙源可以相对于含氨基酸的发酵液中的氨基酸而钙离子成如下摩尔比的方式添加：0.02～2.0、0.05～2.0、0.07～1.5、0.1～1.0、或0.2～0.6，但不限于此。

31、所述钙源的添加步骤可以粉末、水溶液或浆料的形式加入，但不限于此。

32、如上所述，在执行第一步之后，从含氨基酸的发酵液除去细胞，并制备发酵滤液。在对制备的发酵滤液进行第二步的颗粒形成之前，可进行对发酵滤液进行浓缩的浓缩步骤，以增加发酵滤液中氨基酸的浓度。

33、在浓缩步骤中，将发酵滤液浓缩以制备浓缩发酵滤液。浓缩发酵滤液可指减少发酵滤液中包含的溶剂量并相应地增加氨基酸浓度的过程。

34、在浓缩步骤中使用的浓缩装置没有限制。例如，可使用强制循环浓缩管，也可使用桨叶干燥器、浆料干燥设施等，但该装置不限于此。

35、浓缩步骤中的浓度可在大于0％(w/w)且小于或等于75％(w/w)的浓度下进行。浓缩程度是指比较发酵滤液和浓缩发酵滤液时的溶剂除去程度(重量比)。如果浓度超过范围，浓缩溶液会变成凝胶，流动性会显着降低，从而难以进行下一步。然而，上述浓度可能因氨基酸颗粒制备过程中所用设备的类型和/或操作方法而异。例如，浓度可为5％(w/w)以上和75％(w/w)以下，10％(w/w)以上和70％(w/w)以下，或20％(w/w)以上65％(w/w)以下，但不限于此。

36、在浓缩步骤中，如有必要，可额外执行导入钙源的步骤。当发酵滤液在浓缩步骤中浓缩时，溶液中氨基酸的浓度会增加，因此，人们担心氨基酸可能以晶体的形式沉淀，并且可通过在浓缩液中添加钙源来防止浓缩过程中氨基酸的沉淀。特别地，当在上述第一步中未添加钙源时，可在浓缩前后将钙源加入到发酵滤液或浓缩发酵滤液中。

37、还可包括粉碎浓缩物中的晶体的步骤。这可使用传统的均质器来执行，但不限于此。通过粉碎步骤，可减小发酵液中晶体的平均粒径，例如，可防止使用流化床制粒机时可能发生的喷嘴堵塞。

38、如上所述，通过在浓缩物中加入钙源和/或晶体粉碎，可在相对高的浓度下进行浓缩过程，并且随着浓缩度的增加，除去了大量的溶剂，因此，在随后的制粒过程的第二步中可减少需要除去的水量。

39、接下来，进行第二步，从第一步得到的发酵液(在某些情况下，从第一步得到的发酵液的浓缩溶液)制备颗粒。

40、在第二步中，“颗粒”是宏观颗粒(由如粉末等小颗粒组成的较大尺寸的永久性聚集体)，并且可为平均粒径为50μm至5mm、75μm至4mm或100μm至3mm的颗粒。

41、第二步为了从粉末或细小的固体物质形成具有预定尺寸的颗粒而执行，并且可无限制地使用本领域已知的制粒方法进行。例如，可应用将种子通过进料机以恒定速率注入混合型制粒机，同时通过计量液泵供应发酵液以获得颗粒的混合型制粒方法，或者将预定量的种子导入流化床制粒机并在以恒定速率注入预定量的发酵液的同时形成颗粒的混合型制粒方法。特别地，可进一步包括所获得的颗粒的干燥步骤，但不限于此。

42、在第二步中，发酵液中种子与浆料固体的混合比例可为300％(w/w)至900％(w/w)。种子与浆料固体的混合比可与“种子输入比”互换使用。在某些情况下，种子的混合比例可为300％(w/w)至850％(w/w)，350％(w/w)至800％(w/w)，或300％(w/w)至800％(w/w)。在此过程中，通过以上述比例导入种子，可加速颗粒的形成。然而，种子混合比例可能根据工序过程中导入的氨基酸类型、第二步中颗粒形成的工序操作条件等而变化，并且不限于上述范围。

43、本文所用的术语“种子”其也称为种子的晶体或种子晶体，是指用作催化剂用于液体结晶或制粒的物质。具体地，本技术中的种子可指氨基酸晶体，例如，与待制粒的发酵浓缩物中所含的氨基酸类型相同的氨基酸的晶体，但不限于此。当种子与发酵液接触时，发酵液中存在的固体成分与种子结合形成聚集体，从而形成颗粒。

44、例如，此时使用的种子可具有150μm至300μm的平均粒径。具体地，可使用平均粒径为150μm至250μm、200μm至300μm或200μm至250μm的种子，但不限于此。因此，根据本技术，所用种子的粒径可影响颗粒生产的生产率，并且可由本领域技术人员考虑到所需的水分含量而适当地选择。

45、此外，本技术的制备方法，在第二步之前，还可包括将排出的水分率调节为5％(w/w)至50％(w/w)的步骤。在本技术中，术语“排出的水分率”也称为“混合水分率”，是整个混合物中水分的比率，可通过从整个混合物的100％(w/w)中减去总固体％(w/w)来计算。关于本技术，随着排出的水分率的增加，当为了进行后续制粒而发酵液与种子混合并加入混合器时，回收率降低，生产率提高。例如，排出的水分率可调整为5％(w/w)至50％(w/w)、5％(w/w)至45％(w/w)、6％(w/w)至40％(w/w)、10％(w/w)至30％(w/w)或15％(w/w)至30％(w/w)，但不限于此。但是，如果排出的水分率小于上述范围，则由于高粘度单元，可能难以转移浆料，如果超过上述范围，则可能存在下游工序过载和制粒过程中蒸汽过度使用的问题。根据浓缩物中所含氨基酸的类型，排出的水分率范围可能略有不同。

46、排出水分的速率可通过发酵液浆料的输入速率来确定。具体来说，随着浆料输入速率的增加，颗粒状颗粒的水分含量可能会增加，而随着浆料输入速率的降低，颗粒状颗粒的水分含量可能会降低。由于输入速率是根据发酵液浆料的规模确定的，因此本领域技术人员可适当地选择和确定输入速率。

47、此外，本技术的制备方法还可包括选自下列中的一个或多个步骤：发酵液制备步骤；ph调节步骤；浓缩步骤；干燥步骤；和分离步骤。上述每个步骤都可使用本领域已知的方法(us2021-0094903 a1)无限制地执行。此外，可适当改变特定条件以优化过程，但不限于此。

48、根据本技术，可通过如上所述的第一至第二步获得除去细胞的氨基酸颗粒。由于氨基酸颗粒不含细胞，因此产品中的氨基酸含量可至少为50％、60％、70％、75％、80％、85％或90％以上。因此，本技术的制备方法适用于提供氨基酸含量高的产品。

49、【有利效果】

50、本技术的制备方法提供除去细胞的氨基酸颗粒。由于根据本技术提供的氨基酸颗粒不含细胞，因此与含有细胞的其他氨基酸颗粒相比，它在相同重量下具有更高的氨基酸含量。