飞蝗周期蛋白、其编码基因及其dsRNA和应用

本发明涉及昆虫周期蛋白基因及其编码蛋白，尤其涉及从飞蝗中分离的周期蛋白、其编码基因及其dsrna和在调控飞蝗生长发育中的应用，属于昆虫周期蛋白基因及其应用领域。

背景技术：

1、周期蛋白period（per蛋白）是生物钟研究中一个关键的蛋白质，它由 period基因编码。per蛋白在调节昼夜节律（生物钟）方面起着重要作用。昼夜节律是一种内在的生理周期，大约24小时，影响睡眠、激素分泌、体温调节等生理过程。per蛋白是通过一种负反馈机制来调节自身的表达。 period基因被转录成mrna，mrna被翻译成per蛋白。当per蛋白积累到一定水平时，它会进入细胞核，并抑制 period基因的转录，减少新per蛋白的产生。per蛋白与其他蛋白质（如tim蛋白、cry蛋白等）形成复合物，这些复合物可以调控基因的表达，进一步影响生物钟的运作。同时光对per蛋白的表达有显著影响。光照通过影响相关基因和蛋白质的表达，能够重置生物钟，使其与外界环境同步。

2、迄今为止，尚未有从飞蝗中的分离的具有调控飞蝗生长发育功能的周期蛋白的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供从飞蝗中分离的周期蛋白基因 period；

2、本发明的目的之二是提供飞蝗周期蛋白基因所编码的蛋白period；

3、本发明的目的之三是提供抑制或降低飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna；

4、本发明的目的之四是提供含有所述飞蝗周期蛋白基因 period的表达盒、表达载体或重组宿主细胞；

5、本发明的目的之五是将飞蝗周期蛋白基因或其dsrna应用于调控飞蝗生长发育。

6、为实现上述之目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

7、本发明的一方面提供了飞蝗周期蛋白基因 period，其cds的多核苷酸序列为(a)、(b)或(c)所示：

8、(a)seq id no.1所示的多核苷酸序列；

9、或(b)与seq id no.1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有调控飞蝗生长发育的功能或活性；

10、或(c)与seq id no.1的多核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有调控飞蝗生长发育的功能或活性；优选的，与seqid no.1的多核苷酸序列至少有85%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有调控飞蝗生长发育的功能或活性；更优选的，与seq id no.1的多核苷酸序列至少有95%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有调控飞蝗生长发育的功能或活性。

11、本发明的另一方面是提供了飞蝗周期蛋白基因的编码蛋白period，其氨基酸序列为seq id no.2所示。

12、本发明的一种优选的具体实施方案，可以在seq id no.2所示的氨基酸序列的n端和/或c端连接标签；这些标签用于重组蛋白的表达、检测、示踪和纯化等，可以是本领域的各种常用标签，譬如是6xhis、flag、gst、mbp或strep等。

13、本发明的另一方面是提供了用于干扰或抑制飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna；作为一种优选的具体实施方案，所述的干扰或抑制飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna由正义链和反义链组成，其中，所述正义链的核苷酸序列为seq id no.7所示，其反义链的核苷酸序列为seq id no.8所示。

14、本发明还公开了含有所述飞蝗周期蛋白基因的表达盒、表达载体或含有所述用于干扰或抑制飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna的干扰载体。

15、本领域技术人员可以采用本领域的常规技术手段，将飞蝗周期蛋白基因 period通过常规的方法构建得到含有所述飞蝗周期蛋白基因 period的表达盒、表达载体；或者以所述飞蝗周期蛋白基因 period为靶基因设计获得干扰或抑制飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna。

16、本发明进一步提供了含有所述表达盒、表达载体或干扰载体的重组宿主细胞。

17、本发明进一步提供了所述的从飞蝗中分离的周期蛋白基因、其编码蛋白、以该飞蝗周期蛋白基因为靶基因设计得到干扰或抑制飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna在调控飞蝗生长发育中的应用；作为本发明的一种优选的具体实施方案，所述的调控飞蝗生长发育是解除飞蝗卵的滞育或降低飞蝗卵的滞育率；相应的，在防治飞蝗时，通过在越冬时期使飞蝗卵解除滞育或降低飞蝗卵滞育率，使本该在土壤中的蝗卵在来年春天之前提前孵出为幼虫，刚孵出的幼虫在寒冷气候下不能生存，达到隔代防控飞蝗目的。

18、本发明的一种优选的具体实施方案，本发明提供了一种解除飞蝗卵滞育或降低飞蝗卵滞育率的方法，包括：（1）以从飞蝗中分离的周期蛋白基因为靶基因设计获得抑制飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna；（2）将所述dsrna注射到飞蝗体内，降低或抑制周期蛋白基因的表达量或抑制飞蝗周期蛋白的正常功能或活性。

19、本发明从飞蝗体内克隆了飞蝗周期蛋白基因，并对飞蝗周期蛋白基因设计引物，合成了用于干扰飞蝗周期蛋白基因表达的dsrna，在短日照条件下运用注射法将dsrna导入飞蝗对飞蝗周期蛋白基因的表达进行抑制或干扰；干扰实验结果表明：dsrna注射飞蝗后，飞蝗卵的滞育率显著降低，证明本发明所提供的飞蝗周期蛋白或其编码基因具有调控飞蝗生长发育的功能。

20、本发明所涉及到的术语定义

21、除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

22、术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。

23、术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高（例如超过本底至少2倍）。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100%互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献（tijssen, techniques inbiochemistry andmolecular biology-hybridization with nucleic probes, "overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点（tm）约5-10℃。tm为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度（在指定离子强度、ph和核酸浓度下）（因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50%的探针被占据）。严谨条件可为以下条件：其中在ph 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0 m钠离子浓度（或其它盐），并且温度对于短探针（包括（但不限于）10到50个核苷酸）而言为至少约30℃，而对于长探针（包括（但不限于）大于50个核苷酸）而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50%甲酰胺，5×ssc和1% sds，在42℃下培养；或5×ssc，1% sds，在65℃下培养，在0.2×ssc中洗涤和在65℃下于0.1% sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

24、术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

25、术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna（肽核酸）、在反义技术中所用的dna类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代。