一种木质素过氧化物酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种木质素过氧化物酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用。

背景技术：

1、木质纤维素秸秆的成分主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，木质素与半纤维素和纤维素的共价结合阻碍了秸秆组分的有效降解。目前秸秆在利用方面存在较多问题，一方面，秸秆直接还田的自然环境下降解缓慢，肥料化途径附加值较低，造成粮食减产、简易的压板工艺经济效益较差等问题；另一方面，利用秸秆工业原料化途径又存在环境污染问题。此外，工业领域主要采用高温强碱制浆技术去除木质素、高温强酸木糖技术去除半纤维素，这些工艺均存在黑液污染带来禁止或限制发展的问题。

2、生物酶法替代强酸、强碱工艺降解木质素是解决污染、增加效益最有效的手段。然而，由于秸秆中木质纤维素组成成分之间化学键的复杂性，利用具有专一属性单一酶降解木质素存在巨大的障碍。利用不同功能的酶复配为复合酶联合作用降解木质素具有巨大的发展前景，目前已经有该技术方案进入产业化阶段，例如：专利cn 116479670 b等。

3、具有特定功能属性的木质素降解酶，如木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，lip），它的自然酶学属性无法满足在复合酶中特定场景应用条件（如：温度、ph、酶活等）下发挥作用的要求，需要通过基因突变来实现这一目标。

4、木质素过氧化物酶，是血红素过氧化物酶超家族中的一员，是木质素生物降解过程中的主要木质素降解酶类。木质素过氧化物酶表面有两个钙离子结合位点，可以维持蛋白质结构以及保持酶活性。在木质素过氧化物酶活性中心含有血红素和三价铁离子结合位点，因此木质素过氧化物酶多以同工酶的形式发挥作用。在木质素降解酶类当中，木质素过氧化物酶的氧化还原电位较高，可以降解氧化还原电位大于1.4v以上的化合物，它具有催化解聚非酚类木质素模型化合物（如二芳基丙烷）以及多种酚类化合物（如愈创木酚、香草醇、邻苯二酚、丁香酸、乙酰丁香酮等）的能力。

5、木质素过氧化物酶的催化机理类似其他过氧化物酶，木质素过氧化物酶的催化同样依赖h2o2。其有一个配体通道，可使小分子底物通过通道与血红素直接作用。底物的大小和理化性质共同决定其能否通过配体通道与血红素反应。木质素等大分子物质无法通过通道与血红素作用，而是通过酶表面氨基酸残基经远程电子转移机制最终与血红素反应。

6、木质素过氧化物酶主要来源于真菌，适宜在温和的条件下发挥作用，在工业领域复合酶催化体系的应用场景中受到局限，提高木质素过氧化物酶的活性和稳定性是进入工业应用领域的重要条件。

7、蛋白质非理性分子设计是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变体。理性分子设计是在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。相较于非理性设计，理性设计具有工作量小，更易获得有效突变体的优点。

8、因此，本发明中，通过对黄孢原毛齿菌（ phanerodontia chrysosporium）来源的木质素过氧化物酶进行分子改造，获得了稳定性提高的木质素过氧化物酶。随后利用毕赤酵母表达系统，表达制备了稳定性提高的木质素过氧化物酶突变体。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有更高稳定性的木质素过氧化物酶突变体。将黄孢原毛齿菌来源的木质素过氧化物酶基因（ lip）在毕赤酵母中进行表达；利用重叠pcr技术对 lip基因进行突变，并利用abts对突变体进行筛选，获得稳定性提高的突变体。

2、本发明提供的技术方案之一，是一种木质素过氧化物酶突变体，所述突变体是在seq id no.1所示野生型木质素过氧化物酶基础上，发生t158v和a161p突变获得的，将所述突变体命名为t158v/a161p；

3、进一步地，所述木质素过氧化酶t158v/a161p突变体，氨基酸序列如seq id no.3所示；

4、更进一步地，所述t158v/a161p突变体的编码基因，核苷酸序列如seq id no.4所示。

5、本发明提供的技术方案之二，是包含上述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株。

6、进一步地，采用的表达载体为ppic9k，表达宿主为 p. pastorisgs115。

7、本发明提供的技术方案之三，是上述重组质粒或重组菌株在生产技术方案之一所述木质素过氧化物酶突变体中的应用。

8、本发明提供的技术方案之四，是技术方案一所述木质素过氧化物酶突变体在降解木质素中的应用。

9、本发明提供的技术方案之五，是技术方案一所述木质素过氧化物酶突变体在降解秸秆中的应用。

10、本发明中采用以下定义：

11、氨基酸和dna核酸序列的命名法：氨基酸残基命名采用公认的iupac命名法，用单字母或三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。

12、木质素过氧化物酶突变体的标识采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示lip突变体中突变的氨基酸。如t158v，表示位置158的氨基酸由野生型lip的thr替换成val；a161p，表示位置161的氨基酸由野生型lip的ala替换成pro。位置的编号对应于seq idno.1中野生型lip成熟肽的氨基酸序列编号。

13、在本发明中，lip代表野生型木质素过氧化物酶，t158v/a161p代表木质素过氧化物酶突变体，小写斜体 lip代表野生型木质素过氧化物酶lip的编码基因，小写斜体 lipm代表突变体t158v/a161p的编码基因。

14、

15、有益效果

16、本发明对lip野生型进行分子改造，获得了活力和在40℃下稳定性相较于野生型提高的突变体t158v/a161p，突变体t158v/a161p的活力提高到野生型lip的130.5%，40℃下的半衰期提高到野生型lip的186.1%。

技术特征：

1. 一种木质素过氧化物酶突变体，其特征在于，所述木质素过氧化物酶突变体是在seq id no.1所示野生型木质素过氧化物酶基础上，发生t158v和a161p突变获得的，氨基酸序列如seq id no.3所示。

2.权利要求1所述木质素过氧化物酶突变体的编码基因。

3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述木质素过氧化物酶突变体的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。

4.包含权利要求2所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株。

5.权利要求4所述重组质粒或重组菌株在生产权利要求1所述木质素过氧化物酶突变体中的应用。

6.权利要求1所述木质素过氧化物酶突变体在降解木质素中的应用。

7.权利要求1所述木质素过氧化物酶突变体在降解秸秆中的应用。

技术总结本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种木质素过氧化物酶突变体及其基因、工程菌、制备方法与应用。所述木质素过氧化物酶突变体是在SEQ ID NO.1所示野生型木质素过氧化物酶基础上，发生T158V/A161P突变获得的，相对于野生型，突变体酶活以及在40℃下稳定性有一定程度的提高，有利于拓展在降解木质素、纸浆漂白等工业领域中的应用。技术研发人员：路福平,刘逸寒,陈竞宇,臧立华,赵蕾受保护的技术使用者：天津科技大学技术研发日：技术公布日：2024/9/26