一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法与流程

本发明属于生物技术及质谱检测领域，具体涉及一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法。

背景技术：

1、人体内的蛋白质都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，而肽也是由氨基酸构成。实际上，肽与蛋白质之间并没有特别严格的区分。肽的种类可以根据分子量的大小划分，在180～1000kd之间的称为小肽、寡肽、低聚肽，也称为小分子活性肽。小分子活性肽，无需消化分解，可以直接被小肠吸收，最终经人体细胞、组织、器官及血液大循环供身体各功能所用。所以“小肽”是人体吸收蛋白质的主要形式，研究肽实际上就是研究生物活性肽，研究生物活性肽，实际上就是研究小肽。

2、相较于蛋白质，小分子短肽氨基酸具有更高的生物活性和生物利用度，在细胞内和生物体内发挥着重要的作用。具有生物学活性的小分子短肽又称生物活性肽。一般生物活性肽都具有抗氧化、抗菌、抗癌、免疫调节等众多生物学功能，因此生物活性肽在医药、化妆品、食品等众多领域应用广泛。随着生物技术和合成生物学的发展，小分子肽的研究和应用也逐渐向个性化和定制化方向发展。因此急需开发一种快速准确的小分子短肽氨基酸的检测及分析方法。

3、测定小肽氨基酸序列的最好方法是质谱分析。质谱分析是一种通过测量分子离子的质荷比(m/z)来确定化合物分子质量的技术，具有高度的准确性和灵敏性。在质谱分析中，分析样品先被离子化，然后进入超高效液相色谱质谱联用仪，对物质进行分离和鉴定，结合质谱数据库信息注释和分类，精准定性，帮助我们从整体上了解样本的性质，详细的描述样本中的小分子短肽氨基酸物质组成和含量等信息。

4、目前，对生物体内的内源性多肽检测主要集中在六肽以上，对于小分子短肽氨基酸的检测会有很大的缺失。而生物活性小分子短肽氨基酸的检测主要采用分离纯化的方法，耗时长，且后续理化试验验证并不一定会具有活性，整个研究周期会很长。因此传统的方法并不利于小分子活性多肽的开发利用。随着科技的不断进步，小分子短肽氨基酸在未来的研究和应用中将发挥越来越重要的作用。

5、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法，能够对样品中的小分子短肽氨基酸进行一种高通量的检测，数据库比对精准，后续的生物信息分析可以对检测结果做到一种批量化的活性筛选，进而为生物药品及功能性食品开发等提供科学依据。

2、本发明提供了一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤s1，使用lc-ms仪器分析平台，对样品的提取物采用dda正/负离子模式检测，得到质谱raw文件；步骤s2，使用数据分析软件对步骤s1中得到的质谱raw文件进行保留时间矫正、峰识别及峰提取，并利用谱图信息比对数据库进行物质鉴定，得到样品中的小分子短肽氨基酸鉴定结果；步骤s3，使用生物信息学网站预测软件对小分子短肽氨基酸鉴定结果进行生物活性预测。

3、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，lc-ms仪器分析平台的色谱柱的规格为zorbax eclipse plus c18 2.1*100mm*1.8μm。

4、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤s1中，lc-ms仪器分析平台的流动相的流速为0.3ml/min，进样量2μl，色谱分离梯度条件为：

5、0min-2min保持95％a液，5％b液；2min-6minb液从5％上升至30％，a液从95％下调至70％；6min-7min保持70％a液，30％b液；7min-12min％b液从30％上升至78％，a液从70％下调至22％；12min-14min,保持78％a液，22％b液；14min-17min，b液从78％上升至95％，a液从22％下调至5％；17min-20min,保持95％a液，5％b液；20min-21min,b液从95％下调至5％，a液从5％上升至95％；21min-25min，保持95％a液，5％b液。

6、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，采用dda正/负离子模式检测具体为:full ms-ddms2模式，正/负离子扫描，分辨率120000；其中正模式参数为：加热器温度325℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；吹扫气流速：1arb；电喷雾电压：3.5kv；毛细管温度：330℃；s-lens rf level：55％；负模式参数为：加热器温度325℃；鞘气流速：45arb；辅助气流速：15arb；吹扫气流速：1arb；电喷雾电压：3.5kv；毛细管温度：330℃；s-lens rf level：55％。

7、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，数据分析软件为赛默飞compound discoverer 3.3，谱图信息比对数据库包括chemspider在线一级数据库，生物信息学网站预测软件为peptideranker。

8、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，谱图信息比对数据库还包括thermo mzcloud在线二级数据库和thermomzvalut本地二级数据库。

9、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，样品的提取物由样品的前处理提取方法得到，具体包括以下步骤：步骤s0-1，称取0.05g-0.2g样品于2ml离心管中；步骤s0-2，向离心管中加入钢珠和甲醇水溶液，使用高通量组织研磨仪研磨破碎，取出后涡旋并超声；步骤s0-3，超声后样品于低温环境下高速离心，取上清液过滤，备用上机。

10、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，甲醇水溶液为70％甲醇溶液，离心管为thermo低蛋白吸附离心管，高通量组织研磨仪研磨破碎为全自动样品快速研磨仪。

11、在本发明提供的一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤s0-1中，将样本在液氮环境下研磨后取样，步骤s0-3中，于4℃低温下12000rmp离心10分钟，使用0.22μm ptfe有机滤头过滤取上清液。

12、发明的作用与效果

13、本发明提供了一种小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法，利用lc-ms-ms对小分子短肽氨基酸进行检测，并使用谱图信息比对数据库进行小分子短肽氨基酸的鉴定，从而达到对其进行定性定量分析的目的。最后对质谱小分子短肽氨基酸鉴定结果进行生物信息学分析，对里面的生物活性肽进行活性预测。

14、本发明提供的小分子短肽氨基酸的质谱鉴定与分析方法，处理简单，可以快速有效地对样品中的小分子短肽氨基酸进行一种高通量的检测，数据库比对精准，后续的生物信息分析可以对检测结果做到一种批量化的活性筛选，进而为生物药品及功能性食品开发等提供科学依据，具有广泛的临床应用价值。