一种基于温敏性凝胶的牛黄体内培植方法与流程

本发明属于牛黄体内培植的，具体涉及一种基于温敏性凝胶的牛黄体内培植方法。

背景技术：

1、牛黄是脊索动物门哺乳纲牛科动物牛肝脏的胆结石。在胆囊中产生的称“胆黄”或“蛋黄”，在胆管中产生的称“管黄”，在肝管中产生的称“肝黄”。传统的人工牛黄在制造过程中牛黄的成形差，牛黄的制造质量低，主要原因包括：无额外注入的大肠杆菌使牛的胆囊或胆管发生细菌或寄生虫感染，无法形成持续有效的牛黄小颗粒；其次，牛黄小颗粒形成时无相应结构对这些小颗粒进行富集，导致牛黄核心成型速度极慢，最终的牛黄成品不是很少就是没有。为此，需要借助牛黄床，牛黄床(核心)的制作是牛黄生成的基质，是牛黄培植的关键。

2、现有专利cn202210870068.x公开了三维复合牛黄体内培植方法，包括如下步骤，s1：植入牛黄床，s2：植入牛黄菌，s3：饲养，s4：添加剂添加进行饲养；该三维复合牛黄体内培植方法。具有附着性更好的特点，更容易聚集胆汁中的游离胆盐颗粒。现有专利cn202010124954.9公开了一种可拆卸牛黄床及牛黄培植方法，可拆卸牛黄床包括网格状骨架和吸附薄膜，吸附薄膜设置在骨架内表面，骨架从上到下依次包括上盖、床体和下盖，上盖、床体和下盖相互之间活动连接，上盖、床体和下盖内均设置有相匹配的孔隔，骨架侧面设置有缓冲层。然而，上述公开的牛黄床具有以下缺陷：

3、①牛黄床的骨架结构固定，整体外形不可变，植入牛体内时需要切割的创口比较大，不利于牛体健康的恢复。在进行样胆囊插管植黄床手术时，切口一般需要10cm；三维复合牛黄体内培植方法采用开腹手术植入黄床切口需要8cm，胆囊上也会有1.5cm的开口。可拆卸牛黄床及牛黄培植方法中采用的开腹手术植入黄床切口需要4-6cm；且术后均需要复杂的缝合及至少一周的精心护理期，才能恢复常规饲养，整个过程操作复杂，需要专业人士专业器具，且可能会对牛的健康和育肥产生不良影响；

4、②主体组合式连接结构的牛黄床整体稳定性较差，当黄床主体内部胆汁硬化结块后，产生的膨胀可能导致连接件松动失效，进一步导致牛黄床组件脱离，影响植体牛的健康；

5、③牛黄床中的多层结构容易导致胆汁流动受阻，很难穿过黄床内部，且牛黄的收集方式为单向收集，会导致牛黄小颗粒的大量流失，培植的牛黄质量差。

6、现有专利cn118020715 a公开了一种牛黄体内培植方法，包括：用注射器对牛胆囊进行穿刺，抽离胆汁；步骤二、抽离胆汁后，先注射钙盐溶液至胆囊，然后立刻注射多糖溶液至胆囊，使两种溶液在胆囊内产生交联反应，形成网状凝胶状牛黄床；本发明采用注射方式在牛胆囊内生产有机牛黄床，在胆囊内有很好的吸附性，有利于牛黄晶体的吸附，缩短牛黄生产周期，有效解决了以往手术植入牛黄床对牛的刺激，牛黄吸附性差，手术感染造成疾病的各种问题。然而，由于牛胆囊内的液体是动态的，该方法无法保证在牛胆囊内可以稳定的形成网状凝胶状牛黄床，其次，钙盐和多糖溶液生成弱凝胶，生成的网状凝胶状牛黄床的交联度以及网络结构不可控，无法满足在形成牛黄初始核心期间不降解。该方法也无法保证形成形状规则的牛黄床，很难达到一般牛黄床的富集效果。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于温敏性凝胶的牛黄体内培植方法，旨在解决上述的问题。本发明可以适用于牛、羊等动物体内结石或者结晶的富集成型。

2、本发明主要通过以下技术方案实现：

3、一种基于温敏性凝胶的牛黄体内培植方法，包括以下步骤：

4、步骤s1：制备常温下可注射的温敏性聚丙烯酰胺水凝胶；

5、步骤s2：将牛黄床植入到牛胆囊内；

6、步骤s3：将所述步骤s1制备的温敏性聚丙烯酰胺水凝胶与牛黄转化菌混合，并注射导入牛黄床内；

7、或者先将所述步骤s1制备的温敏性聚丙烯酰胺水凝胶注射导入牛黄床内，然后，将牛黄转化菌注射导入牛黄床内；

8、步骤s4：进行正常饲养。

9、为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤s1中，采用n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和n,n′-亚甲基双丙烯酰胺聚合反应，得到常温下可注射的温敏性聚丙烯酰胺水凝胶；所述n-异丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺的摩尔比为10-3：1；所述n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的含量为单体总摩尔数的1％-2％。

10、为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤s1包括以下步骤：

11、步骤s11：将n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺、n,n′-亚甲基双丙烯酰胺和表面活性剂加入反应器中搅拌溶解；

12、步骤s12：在惰性气体环境中加热到40-80℃，然后，在反应器中加入引发剂，反应得到凝胶分散水溶液。

13、为了更好地实现本发明，进一步地，在50ml的溶液中，所述n-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和n,n′-亚甲基双丙烯酰胺的用量分别为42mmol、7.4mmol和0.53mmol；所述引发剂为过硫酸钾，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述十二烷基硫酸钠和过硫酸钾的用量分别为0.08g和0.22g。

14、为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤s1还包括步骤s13：在步骤s12制备的凝胶分散水溶液中加入海藻酸钠以及相容单体和/或相容剂，混合搅拌均匀；然后，加入黏蛋白和牛黄转化菌的营养物质，混合搅拌均匀，得到可注射的凝胶水溶液；所述步骤s3中，先将步骤s13制备的可注射的凝胶水溶液导入牛黄床，然后，将牛黄转化菌和钙盐溶液注射导入牛黄床内。

15、为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤s1还包括步骤s13：在步骤s12制备的凝胶分散水溶液中加入海藻酸钠以及相容单体和/或相容剂，混合搅拌均匀；然后，加入牛黄转化菌以及黏蛋白、牛黄转化菌的营养物质，混合搅拌均匀，得到可注射的凝胶水溶液；所述步骤s3中，先将步骤s13制备的可注射的凝胶水溶液导入牛黄床，然后，将钙盐溶液注射导入牛黄床内。

16、为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤s13中，所述相容单体、相容剂、海藻酸钠和钙盐的摩尔比为0.01-0.1：0.015-0.2：1-20：0.5-5；所述相容单体为多巴胺、单宁酸、花青素、儿茶素、木质素中的任意一种或者多种，所述相容剂为聚乙烯醇、聚乙二醇、淀粉、纤维素中的任意一种或者多种。

17、为了更好地实现本发明，进一步地，所述相容单体为单宁酸，所述相容剂为聚乙烯醇，且聚乙烯醇的型号为1788型，所述钙盐为乳酸钙；在50ml的溶液中，所述单宁酸、聚乙烯醇、海藻酸钠和乳酸钙的用量分别为0.044mmol、0.067mmol、8.7mmol和2.3mmol。

18、为了更好地实现本发明，进一步地，所述步骤s2中，所述牛黄床为可压缩结构，将压缩状态的牛黄床植入到牛胆囊内，牛胆囊内的牛黄床处于膨胀状态。

19、为了更好地实现本发明，进一步地，采用微创的形式将压缩状态的牛黄床植入到牛胆囊内。本发明可以将压缩状态的牛黄床以微创的方式植入到牛胆囊内，所述微创的植入方式为现有技术，具体可以选择内窥镜或者穿刺针等实现，故不再赘述。本发明采用可压缩的牛黄床以及可注射的温敏性聚丙烯酰胺水凝胶，实现了微小创口的导入牛胆囊中，解决了现有牛黄体内培植创口过大的问题，提高了培植牛黄的产量和质量，具有较好的实用性。

20、为了更好地实现本发明，进一步地，所述牛黄床包括黄床主体和盖体以及弹性骨架，所述黄床主体的两端分别沿周向设置有波浪状的弹性骨架，所述黄床主体为镂空结构，且黄床主体的两端端部分别设置有柔性的盖体，所述盖体的中部设置有流动孔。

21、为了更好地实现本发明，进一步地，所述黄床主体由纱网制备得到，所述盖体由pet网布制备得到，所述弹性骨架由形状记忆合金制备得到。

22、如图1所示，牛黄的成核机理如下：

23、牛的肝脏会分泌胆固醇与葡萄糖醛酸酯，胆固醇进一步合成胆酸，而胆酸可以分解成游离胆酸。

24、葡萄糖醛酸酯会转化成葡萄糖醛酸胆红素，牛黄转化菌(大肠杆菌)分泌的β-葡萄糖醛酸酶会促使葡萄糖醛酸胆红素分解成游离胆红素。

25、游离胆红素、游离胆酸会和钙离子形成胆红素钙。胆红素钙会进一步与黏蛋白形成胆红素钙蛋白高聚物，即牛黄小颗粒。

26、进一步地，牛黄转化菌(大肠杆菌)可以分泌β-葡萄糖醛酸酶，它可以水解可溶性的结合胆红素(cb)变为非结合胆红素(ucb)，后者与钙、镁等金属离子结合形成胆红素钙盐沉淀，其进一步与蛋白—多糖复合物聚合形成牛黄小颗粒。牛黄转化菌(大肠杆菌)在活动过程中一方面产酸，使胆汁ph值下降，酸性环境引起胆汁中蛋白质的沉降；另一方面，它利用胆汁中的蛋白质、碳水化合物等大分子物质，结果导致胆汁的粘度下降。新形成的牛黄小颗粒，在高粘度的胆汁中易悬浮，不易沉降和粘附；在低粘度的胆汁中，则易发生沉淀、附着和聚集，并形成大的牛黄团块；牛黄小颗粒快速形成大团块后，不易因胆汁流动而丢失。

27、其次，牛黄转化菌(大肠杆菌)可以降解胆汁中的胆酸，导致胆酸的含量下降。胆汁中的胆酸对游离胆红素(ucb)有助溶作用，抑制ucb与钙、镁等金属离子的结合；胆酸本身尚可与钙离子结合，抑制胆红素钙盐的形成。胆汁、胆酸的含量减少，有利于ucb与钙、镁等金属离子的结合，从而促进牛黄的形成。

28、牛黄转化菌(大肠杆菌)可以产生黏液，一方面增加胆汁的黏度，有利于牛黄颗粒的聚集；另一方面可能参与牛黄的形成。

29、牛黄的形成主要包括三个阶段：化学阶段，包括胆汁成份改变、胆固醇结晶和胆色素颗粒析出；物理阶段，通过一定的核心、框架使析出成分凝集成形；成长阶段，即在雏形结石不被胆汁流冲走的条件下，胆汁中析出成分在雏形结石上逐层累积沉淀过程。其中胆色素颗粒的析出是重要的一环。如图1所示，胆囊内部的牛黄床中牛黄颗粒的聚集机理如下：

30、胆汁会携带以上物质进入黄床，在黄床内部形成牛黄小颗粒，且牛黄小颗粒直接沉积在牛黄床上。但是胆汁一直会流动，因此这部分形成的较少。更多的是胆汁携带牛黄小颗粒进入牛黄床，被凝胶吸附，胆汁则从牛黄床的孔隙中流出。

31、在牛黄核心形成初期，凝胶作用十分显著。首先牛黄床内部的凝胶承载着粘蛋白与营养物质，在初期牛黄转化菌(大肠杆菌)与营养物质会暴释，大肠杆菌会进入胆管、胆囊等组织感染牛体组织并繁殖生长，为牛黄小颗粒的形成提供基础条件。其次，牛黄床内部的凝胶还会富集牛黄小颗粒。若无凝胶吸附小颗粒，胆汁会携带牛黄小颗粒从牛黄床的流动孔流出，即使有部分黏着在壁上，也是散乱分布无法形成核心。若无牛黄床在外保护，凝胶会很快降解，且其粘性维持时间也较短，无法持续2-3个月稳定地收集牛黄小颗粒。

32、牛黄核心的形成时间大概是2-4个月，本发明制备的凝胶的降解时间满足该要求，本发明制备的凝胶与牛黄核心形成核壳结构。一般的凝胶在体内降解速度会是逐渐加快的一个过程，因为降解初期结构，交联度完好，降解速度较慢，随着结构与交联网络被破坏速度会逐渐加快。但是因为此核壳结构，凝胶外部被牛黄包裹，可以延缓其降解时间。随着凝胶结构被破坏，凝胶的比表面积也在增加，其会提供更多的空位给牛黄小颗粒。在牛黄形成后期，凝胶的降解速度和牛黄的成长也会形成一种动态平衡。

33、本发明通过n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)、丙烯酰胺(aam)和n,n′-亚甲基双丙烯酰胺(mbaam)单体进行自由基聚合，制备得到交联的聚丙烯酰胺水凝胶，即凝胶分散水溶液。其中过硫酸钾(kps)作为聚合反应的引发剂，加速自由基的生成以及n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)、丙烯酰胺(aam)单体的聚合反应；n,n′-亚甲基双丙烯酰胺(mbaam)作为交联剂，能以共价键的形式连接丙烯酰胺(aam)聚合形成的分子链，从而形成三维高分子网络结构的聚丙烯酰胺水凝胶。

34、在聚合过程中，n-异丙基丙烯酰胺和丙烯酰胺的烯键碳碳双键接受引发剂(过硫酸铵)打开，出现碳正离子，碳正离子在攻击另一个双键，类似烷烃光反应的链增长部分，但是由于加入了n,n′-亚甲基双丙烯酰胺，他也可以被碳正离子攻击，参与其聚合反应，所以会在聚丙烯酰胺的单链之间出现，形成立体的空间网状结构，延长了制备凝胶的降解时间，满足了牛黄初始核心形成的周期。

35、所述nipaam中含有疏水的异丙基和亲水的酰胺基团，因此有着温敏特性。提高亲水基团的含量可以提高lcst的温度，因此引入同样有酰胺键的丙烯酰胺(aam)，可以增加亲水基团的占比。因此，本发明还提高了凝胶的lcst温度，可以让整个水凝胶在更接近牛体温度(37-40℃)的条件下发生相转变，方便注射导入牛的胆囊中的同时，可以快速转变成易于富集牛黄颗粒的粘稠状态，提高了牛黄培植的效率。

36、本发明在上述制备的聚丙烯酰胺水凝胶的基础上，通过钙离子与海藻酸钠(sa)分子链上的羧基形成配位键可瞬间形成交联的凝胶网络的特性，最终可以形成双网络相互缠结的互穿网络结构的温敏性凝胶。所述单宁酸(ta)与聚乙烯醇(pva)的加入，增强了两层凝胶网络的相容性。聚乙烯醇富含羟基，可以和单宁酸(ta)、聚丙烯酰胺水凝胶形成氢键，增强了互穿网络结构的温敏性凝胶的连接相容性和交联强度。其次，单宁酸(ta)富含多酚基团，其不仅会氧化产生醌基，可以和蛋白质的氨基、巯基形成共价结合；还可以与羟基，羰基形成氢键，因此可以很好的附着黏蛋白，促使牛黄颗粒在凝胶表面富集成型，具有良好的吸附牛黄小颗粒的功能。

37、本发明的有益效果如下：

38、(1)本发明采用微创器械将可压缩牛黄床导入牛胆囊中，以及采用注射的方式在牛黄床中导入凝胶溶液，所产生的创口仅1cm。不需要复杂的手术器械及开腹缝合操作，且术后不用复杂的护理，一天后既可常规饲养，不会对牛的健康或育肥产生不良影响。

39、(2)本发明制备的温敏性聚丙烯酰胺水凝胶的相转变温度为37-40℃，可以满足常温下可注射的形式，且在牛胆囊体内呈现粘稠状态，扩大了对牛黄小颗粒的附着面积以及对牛黄小颗粒的粘着性。本发明将凝胶注射入牛黄床中，温敏性凝胶在牛黄床中富集形成牛黄初始核心。所述牛黄床对凝胶进行保护，使凝胶不会被快速降解，同时牛黄床的保护使凝胶的粘性维持时间延长，实现稳定持续的富集牛黄小颗粒，形成牛黄初始核心，有利于牛黄体内培植的效率和质量，具有较好的实用性。

40、(3)本发明直接将牛黄转化菌及其营养物质混入凝胶中，在牛胆囊中，凝胶会一边富集牛黄颗粒，一方面释放牛黄转化菌，持续释放的牛黄转化菌可以使胆囊或胆管发生细菌感染，形成持续有效的牛黄小颗粒。本发明将牛黄转化菌与凝胶形成混合物再植入牛黄床，能保证菌浓度，也能保证牛黄床复合体悬浮于胆汁里，还能增加牛黄小颗粒的收集效率，具有较好的实用性。

41、(4)本发明为了快速使牛的胆囊或胆管发生细菌感染，先将温敏性聚丙烯酰胺水凝胶注射导入牛黄床内，然后紧接着在牛黄床内注射牛黄转化菌，其中牛黄转化菌一部分会快速感染牛胆囊，一部分会负载在凝胶中。大浓度释放的牛黄转化菌会快速使牛的胆囊或胆管发生细菌感染，初期促使形成大量的牛黄小颗粒，负载在凝胶表面的牛黄转化菌会持续释放，保证了后期牛黄核心的稳定形成，具有较好的实用性。

42、(5)牛黄转化菌是牛黄形成过程的重要环节，它可以为牛黄的形成创造条件。凝胶一方面可以装载牛黄转化菌，保证其不被流动的胆汁冲走，同时其还可以装载促进牛黄转化菌生长所需要的生长因子、营养蛋白等，另一方面，凝胶本身就是一种营养物质，可以作为牛黄转化菌生长的营养源泉，其次凝胶还可以吸附游离在胆汁中的牛黄小颗粒，保证牛黄小核心的形成，而牛黄床则可以保证凝胶复合物在胆汁内原位凝固时有一个规则的形状。

43、(6)现有传统未交联的n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)聚合物的相转变温度(lcst)温度为30-32℃，加入丙烯酰胺(aam)可改善聚丙烯酰胺水凝胶的温敏特性，使其相转变温度更接近牛体温度，可以让整个水凝胶在更接近牛体温度(37-40℃)的条件下发生相转变，方便将聚丙烯酰胺水凝胶注射导入牛的胆囊中，还可以快速的将聚丙烯酰胺水凝胶转变成易于富集牛黄颗粒的粘稠状态，提高了牛黄培植的效率。

44、(7)本发明首先制备得到可以在牛体内相转变的可注射的凝胶水溶液，然后基于注射加入的钙盐溶液，制备得到互穿网络结构的温敏性凝胶。本发明制备的凝胶的降解时间满足牛黄初始核心形成的时间要求，也满足方便操作的要求，易于富集牛黄颗粒。本发明制备的互穿网络结构的温敏性凝胶，在延长了凝胶降解时间的同时，还增加了凝胶中可附着的面积，而且提高了凝胶对牛黄颗粒的附着强度，有效提升了牛黄培植的质量，具有较好的实用性。

45、(8)牛黄床加凝胶复合物的组合可以使整个黄床复合体的密度与胆汁相近且略高，可以让它沉浸于胆汁中。牛黄床本身体积小，重量轻，在还未形成牛黄核心前，由于中心填充了可降解凝胶复合物，且凝胶降解程度低，整个复合体能很好的悬浮于胆囊中；在牛黄核心形成后，凝胶降解程度增大，牛黄核心重量增加，整个黄床质量不发生变化。因此在整个培育过程中牛黄核心的形成与凝胶的降解可以处于一个平衡状态，能保证从黄床植入、牛黄核心的形成到凝胶完全降解、直至最后取黄过程中，整个黄床一直悬浮于胆汁中。只有在末期，牛黄大量聚集到将整个牛黄床包裹住后半悬浮或沉于胆囊底部。由于此时牛黄床被牛黄包裹住几乎不会直接接触到胆囊内壁，整个复合体能接触胆囊壁的只有形成的牛黄，其外表光滑，对胆囊上皮细胞与组织的刺激性小，能保证植体牛的健康状态不受影响。