高杀线虫活性紫色紫孢菌工程菌ΔPlGyp1及其构建方法和应用

本发明属于生物农药，具体地说，涉及高杀线虫活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1及其构建方法和应用。

背景技术：

1、植物寄生线虫每年造成全球粮食减产，经济损失巨大。基于植物寄生线虫大多分布广、寄主多、致病性强、减产率高、繁殖快、易传播等特点，其在农业生产中具有举足轻重的经济生态地位，防治植物寄生线虫被广泛关注。

2、目前，防治植物寄生线虫的主要方法是施加化学药剂(gamalero et al.,2020)。由于化学杀线药剂因毒性大、污染环境、对人畜健康存在潜在威胁，生物防治作为一种安全有效的手段被广泛研究和应用(diyapoglu et al.,2022；ismail,2014)。食线虫真菌凭借突出的线虫防治效果、独特的杀线虫方式、对环境无污染、对人畜无害以及持效期长等优点被广泛关注，现已成为生物防治线虫的主要微生物资源，在线虫防治管理中起着至关重要的作用(tranier,2014)。

3、2011年，luangsa-ard通过比较分离菌株的18s rrna、its和tef序列差异，提出一个新属，属名为紫孢菌属(purpureocillium)，基于医学重要性，将其重新命名为淡紫紫孢菌(purpureocillium lilacinum)，并指定为紫孢菌属的模式种(luangsa-ard et al.,2011；prasad et al.,2015；srilakshmi et al.,2017)。紫孢菌属除包括淡紫紫孢菌外，还有紫色紫孢菌(purpureocillium lavendulum)(perdomo et al.,2013)等5个种。紫孢菌属物种不仅具有广谱ph耐受性，也能在各种基质上生长(cavello et al.,2013)。

4、与淡紫紫孢菌相比，紫色紫孢菌在35℃以上不生长，人畜安全性更高，该真菌作为生物防治剂具有很好的应用前景(desaeger,2019)。紫色紫孢菌能够产生多种活性物质达到杀线虫的能力，基于其人畜安全性高，现其代谢物已作为生防植物寄生线虫的活性成分被广泛研究微生物菌剂防治植物线虫。目前，微生物菌剂防治植物线虫存在防效低和不稳定的问题，筛选鉴定重要的毒力及调控基因非常重要，突变体库筛选是有效寻找新功能基因的方法。因此，构建筛选紫色紫孢菌突变体库，挖掘未知基因资源，在防治植物线虫生物制剂的研究中尤为重要。

技术实现思路

1、为了克服背景技术中的问题，本发明提供了一种高杀线虫活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1及其构建方法和应用，本发明通过对紫色紫孢菌(purpureocillium lavendulum)菌株进行基因改造，获得高杀线虫活性的基因工程菌株，具有生长速率更快和形态更大等特点，可用于生物线虫防治以及高效生物杀线虫制剂的开发。

2、为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

3、高杀线虫活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1，所述工程菌δplgyp1是敲除紫色紫孢菌的plgyp1基因获得，工程菌δplgyp1的保藏编号为cgmcc no.41039。

4、进一步地，所述的plgyp1基因的序列如seq id no.1所示，plgyp1氨基酸的序列如seq id no.2所示。

5、高杀线虫活性紫色紫孢菌工程菌δplgyp1的构建方法，具体步骤如下：

6、1)利用同源重组方法构建plgyp1基因敲除载体：以紫色紫孢菌基因组dna为模板，通过引物gyp15f和gyp15r克隆plgyp1基因5’端同源重组片段，通过引物gyp13f和gyp13r克隆3’端同源重组片段；

7、2)将供体质粒ppk2-sur(氯密磺隆抗性基因)-gfp、限制性内切酶xbaⅰ和bglⅱ和plgyp1基因5’端同源重组片段及限制性内切酶bsshⅱ和3’端同源重组片段进行infusion克隆反应得到plgyp1基因敲除载体；

8、3)将plgyp1基因敲除载体转入农杆菌中得到含plgyp1基因敲除载体的农杆菌；

9、4)将含plgyp1基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌；

10、5)筛选gyp1转化子，并依次采用验证引物对y5’f/y5’r、y3’f/y3’r、gyp1-f/gyp1-r和sur-f/sur-r进行验证，即得高杀线虫活性紫色紫孢菌的工程菌δplgyp1。

11、进一步地，步骤1)中，所述的引物gyp15f和gyp15r用于扩增plgyp1基因上游2005bp片段；

12、引物gyp15f的序列为cacgaggacttctagtctagcttgcttctgccttctctgg；

13、引物gyp15r的序列为gcgttggcacagatcagatcttcttgccgctccctgat。

14、进一步地，步骤1)中，所述的引物gyp13f和gyp13r用于扩增plgyp1基因下游2034bp片段；

15、引物gyp13f的序列为gagagctgatgcgcggcgcgtacgagcactcacgaaatcc；

16、引物gyp13r的序列attcgtcctcgcgcggcgcgaccccaacaccaccaagc。

17、进一步地，步骤3)中，将plgyp1基因敲除载体转入农杆菌的具体步骤为：

18、a.将农杆菌感受态进行冰上融化后，加入10μl构建好的plgyp1基因敲除质粒并混合均匀，依次进行冰浴5min，液氮速冻5min，37℃水浴5min，冰浴5min处理；

19、b.加入800μl无抗生素的lb液体培养基，置于温度为28℃、180rpm振荡培养2～3h，使农杆菌体复苏，6000rpm离心1min富集菌体，弃上清液，吹打重悬菌体，在lb+kan平板上涂布均匀，置于28℃培养箱中倒置培养48～72h；

20、c.待单菌落长出后，挑取单菌落划线并进行菌落pcr验证，即得到含有plgyp1基因敲除的农杆菌。

21、进一步地，步骤4)中，将含plgyp1基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌的具体步骤为：

22、a.接种含plgyp1基因敲除载体的农杆菌于含kan+的lb液体培养基中，28℃培养条件下，180rpm培养至od660＝0.5～0.8；取含农杆菌液体lb，其体积＝1.5/所测od值，将其分装于ep管内，离心富集农杆菌菌体；

23、b.在超净台内，取两个加入葡萄糖和乙酰丁香酮的液体im的锥形瓶，重悬农杆菌加入一个im锥形瓶中，置于28℃条件下，180～220rpm避光诱导至od660≈0.45，未加入重悬农杆菌的im锥形瓶作为空白对照；加热im培养基，在超净台避光加入葡萄糖和乙酰丁香酮，倒平板，待其冷却凝固，避光铺上灭菌的微孔滤膜，用报纸避光；

24、c.用b步骤中的对照组im培养基稀释紫色紫孢菌孢子浓度至1×105个/ml，避光操作；待农杆菌od660≈0.45后，避光在超净台将农杆菌悬液与孢子悬液加入离心管中1:1混匀；取混合液涂于平板上，对照组涂稀释后的孢子悬液，倒置于温度为22℃条件下，避光倒置培养48h；

25、d.加热后的m-100培养基冷却至不烫手，在超净台中加入头孢霉素和sur；将微孔滤膜转移到含头孢霉素和sur的m-100培养基上，置于28℃条件下，倒置培养4-5天，直至出现胁迫菌落；

26、e.用加入头孢霉素和sur的mm固体培养基制斜面；从转膜后的m-100培养基微孔滤膜上，用竹签挑取胁迫单菌落，在抗性sur斜面上划线，置于28℃条件下，培养3-4天；长出的真菌可用液体mm摇菌，收集菌丝后用ctab法提基因组进行验证。

27、进一步地，步骤5)中，所述的验证引物对的序列分别为：

28、y5’f序列为cgggaaacgacaatctga；

29、y5’r序列为ccaagtccctccacacaa；

30、y3’f序列为accgctactcacatacacaccag；

31、y3’r序列为gaccccaacaccaccaagc；

32、gyp1-f序列为gcgagggcaagatattacg；

33、gyp1-r序列为gcatcaggaggcagttcat；

34、sur-f序列为cgacgcgatctacaactcgaag；

35、sur-r序列为ttaaccgtgcaggccattcgt。

36、将前述方法构建而成的高杀线虫紫色紫孢菌工程菌δplgyp1应用在制备线虫生防菌剂中。

37、本发明的有益效果：本发明通过对紫色紫孢菌(purpureocillium lavendulum)菌株进行基因改造，利用同源重组方法构建plgyp1基因敲除载体，最后获得高杀线虫活性的基因工程菌株，具有生长速率更快和形态更大等特点，在侵染秀丽隐杆线虫、南方根结线虫以及花生根结线虫条件下，杀线虫活性比原始菌株分别提高近9倍、2.2倍和1.9倍，可用于生物线虫防治以及高效生物杀线虫制剂的开发。