一种阳离子交换层析纯化IgM的方法及IgM的纯化方法与流程

本公开涉及蛋白质纯化的方法，具体涉及采用阳离子交换层析纯化igm的方法，igm的纯化方法，以及通过该方法得到的igm。

背景技术：

1、免疫球蛋白m(igm)是分子量最大的免疫球蛋白，主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞分泌合成。igm通常是在血液和淋巴液中首先响应感染的一类抗体，并能够触发其他免疫系统细胞破坏外来物质。

2、因为igm抗体较大的分子量和复杂程度，一般认为该类型的抗体是比较难以大规模生产的。但是随着细胞系的改进，生产培养基的改良，生产过程的控制使得大规模生产igm抗体成为可能。同时，igm的一些特性也限制了它在标准抗体净化工具中使用，igm抗体溶解性范围较窄，为抗体的纯化带来了比较大的困难。

3、在传统的igm纯化中需要使用羟基磷灰石柱层析法。羟基磷灰石是一种环境友好的含羟基和磷的无机物质，具有优良的生物相容性和生物活性。但是，羟基磷灰石因其价格昂贵、可用循环数少、对于缓冲液的ph要求严苛等缺陷而不适合规模化生产。另外，在igm纯化中常规采用的阳离子层析捕获收率不足，也限制了igm纯化的产量。

4、因此，需要开发新的步骤少且能降低成本的igm纯化方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种纯化目的蛋白igm的方法，以及通过该方法获得的经纯化的目的蛋白igm。

2、根据本公开的一个方面，提供了一种使用阳离子交换层析纯化目的蛋白igm的方法，其中所述阳离子交换层析同时采用电导梯度和ph梯度进行洗脱。

3、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析采用电导率3.0至100ms/cm的梯度进行洗脱。

4、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液的ph＝所述目的蛋白igm的pi-n，其中n≥0.5。

5、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的终ph≥所述平衡缓冲液的ph。

6、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析采用ph 2.0至10.0的ph梯度进行洗脱。

7、在一些实施方式中，所述igm选自igm五聚体或igm六聚体。在一些实施方式中，所述igm为抗cd20的抗体。在一些实施方式中，所述抗cd20 igm为五聚体。

8、在一些实施方式中，所述目的蛋白igm的pi≥6.0。在一些实施方式中，所述目的蛋白igm的pi(等电点)为6.5至13.0。在一些实施方式中，所述目的蛋白igm的pi为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0。在一些实施方式中，所述目的蛋白igm的pi为6.5至8.0。

9、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析可以使用3.0至10.0的ph梯度进行梯度洗脱。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的起始ph可以为约3.0～5.0。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的起始ph可以为约3.0、约3.1、约3.2、约3.3、约3.4、约3.5、约3.6、约3.7、约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9或约5.0。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的终ph可以为6.0～10.0。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的终ph可以为约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5或约10.0。

10、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析可以使用电导率8.0至100ms/cm进行线性洗脱。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析可以使用电导率8.0至30ms/cm进行线性洗脱。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析可以使用电导率8.0至25ms/cm进行线性洗脱。

11、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的起始电导率为约8.0ms/cm、约8.5ms/cm、约9.0ms/cm、约9.5ms/cm、约10ms/cm、约10.5ms/cm、约11ms/cm、约11.5ms/cm约12.0ms/cm、约12.5ms/cm、约13.0ms/cm、约13.5ms/cm、约14.0ms/cm、约14.5ms/cm或约15.0ms/cm。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的终电导率为约20.0ms/cm、约20ms/cm、约21.0ms/cm、约21.5ms/cm、约22.0ms/cm、约22.5ms/cm、约23.0ms/cm、约23.5ms/cm、约24.0ms/cm、约24.5ms/cm、约25.0ms/cm、约25.5ms/cm、约26.0ms/cm、约26.5ms/cm、约27.0ms/cm、约27.5ms/cm、约28.0ms/cm、约28.5ms/cm、约29.0ms/cm、约29.5ms/cm或约30.0ms/cm的缓冲液进行洗脱。

12、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析可以包括以下步骤：使用平衡缓冲液和0～100％的洗脱缓冲液进行线性洗脱。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液具有上述起始ph和/或起始电导率。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液具有上述终ph和/或终电导率。所述线性洗脱的条件为洗脱液由平衡缓冲液逐渐变化至洗脱缓冲液，其中所述洗脱缓冲液的比例从0线性提升到100％。

13、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的起始ph为3.0～5.0。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的起始ph为30.、3.5、4.0、4.5或5.0。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的终ph为6.0～10.0。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的洗脱的终ph为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0。

14、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析可以先使用第一电导率的缓冲液进行预洗脱，然后使用第二电导率的缓冲液进行洗脱，其中所述第一电导率小于第二电导率。在一些实施方式中，所述第一电导率可以为约3～15ms/cm的范围。在一些实施方式中，所述第一电导率可以选自，例如约3ms/cm、约4ms/cm、约5ms/cm、约6ms/cm、约7ms/cm、约8ms/cm、约9ms/cm、约10ms/cm、约11ms/cm、约12ms/cm、13ms/cm、约14ms/cm或约15ms/cm。在一些实施方式中，所述第二电导率可以为约16～100ms/cm。在一些实施方式中，所述第二电导率可以选自，例如约16ms/cm、约20ms/cm、约25ms/cm、约30ms/cm、约35ms/cm、约40ms/cm、约45ms/cm、约50ms/cm、约55ms/cm、约60ms/cm、约65ms/cm、约70ms/cm、约75ms/cm、约80ms/cm、约85ms/cm、约90ms/cm、约95ms/cm或约100ms/cm。

15、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液可以包含钠盐、钾盐、铵盐、钙盐或其组合。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液可以包含氯化钠、乙酸钠、硫酸钠、硫氰酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠，及其钾、镁、铵和钙盐，或以上项的任何组合。

16、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液可以包含氯化钠。

17、在一些实施方式中，所述平衡缓冲液中的氯化钠浓度可以为约40mm至100mm。在一些实施方式中，所述平衡缓冲液中的氯化钠浓度可以为40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm、。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液中的氯化钠浓度可以为约150mm至300mm。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液中的氯化钠浓度可以为150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、210mm、220mm、230mm、240mm、250mm、260mm、270mm、280mm、290mm或300mm。

18、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液包含磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液、tris-hac缓冲液、hepes缓冲液和/或醋酸缓冲液。

19、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液包含氯化钠和/或磷酸盐。

20、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液包含磷酸钠和/或tris-hac。

21、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液包含10～100mm na2hpo4和/或10～100mm tris-hac。在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的平衡缓冲液和/或洗脱缓冲液包含25mm na2hpo4和25mm tris-hac。

22、在一些实施方式中，所述平衡缓冲液包括25mm na2hpo4、25mm tris-hac和50mmnacl。在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液包括25mm na2hpo4、25mm tris-naac和200mmnacl。

23、在一些实施方式中，所述第一电导率的缓冲液为上述平衡缓冲液。在一些实施方式中，所述第二电导率的缓冲液以1:(1.5～2.5)的比例包括上述平衡缓冲液和上述洗脱缓冲液。在一些实施方式中，所述第二电导率的缓冲液以1:1.5、1:2.0或1:2.5的比例包括上述平衡缓冲液和上述洗脱缓冲液。在一些实施方式中，所述第二电导率的缓冲液包括33％的上述平衡缓冲液和67％的上述洗脱缓冲液。

24、在一些实施方式中，所述阳离子交换层析的基质可以包括，但不限于nanogeltm-50sp、自poros hs、poros xs、羧甲基纤维素、bakerbond abxtm、固定在琼脂糖上的磺丙基和固定在琼脂糖上的磺酰基、monos、minis、source15 s、30s、spsepharosetm、cmsepharosetm、bakerbond carboxy-sulfon、wp cbx、wp磺酸、hydrocell cm、hydrocel sp、unosphere s、macro-prep high s、macro-prep cm、陶瓷hyperd s、陶瓷hyperdcm、陶瓷hyperd z、trisacryl m cm、trisacryl ls cm、trisacryl m sp、trisacryl ls sp、spherodex ls sp、dowex细网目强酸阳离子树脂、dowex mac-3、matrex cellufine c500、matrex cellufine c200、fractogel emd so3-、fractogel emd se、fractogel emd coo-、amberlite弱和强阳离子交换剂、diaion弱和强阳离子交换剂、tsk凝胶sp-5pw-hr、tsk凝胶sp-5pw、toyopearl cm(650s、650m、650c)、toyopearl sp(650s、650m、650c)、cm(23、32、52)、se(52、53)、p11、express-ion c和express-ion s等，或其任何组合。

25、本公开通过使用阳离子交换层析对样品进行捕获，目的在于提升捕获的收率，由于后续的精纯步骤具有非常好的去除聚集体和片段的作用，因此，对捕获步骤所得igm蛋白的纯度要求不高。因此，本公开的方法能够在阳离子交换层析步骤获得收率高的洗脱产物，相应地能得到更高产量的最终产物，且纯化所得igm蛋白的质量符合药典要求。

26、根据本公开的另一方面，提供了一种纯化目的蛋白igm的方法，所述方法包括以下步骤：1)对含目的蛋白igm的样品进行如本文公开的阳离子交换层析，得到第一洗脱液；2)对所述第一洗脱液进行阴离子交换层析，得到第二洗脱液；和，3)对所述第二洗脱液进行阴离子交换层析或疏水相互作用层析，得到含目的蛋白的产物。

27、在一些实施方式中，步骤1)的阳离子交换层析按照如本公开的上述内容进行。

28、在一些实施方式中，步骤2)和步骤3)的阴离子交换层析的缓冲液具有约5～15ms/cm的电导率。在一些实施方式中，步骤2)和步骤3)的阴离子交换层析的缓冲液具有约5ms/cm、约6ms/cm、约7ms/cm、约8ms/cm、约9ms/cm、约10ms/cm、约11ms/cm、约12ms/cm、13ms/cm、约14ms/cm、约15ms/cm的电导率。

29、在一些实施方式中，步骤2)和步骤3)的阴离子交换层析的缓冲液的ph＝所述目的蛋白igm的pi-n，其中n≥0.5。在一些实施方式中，所述目的蛋白igm的pi≥6。

30、在一些实施方式中，步骤2)和步骤3)的阴离子交换层析的洗脱的终ph≥所述平衡缓冲液的ph。

31、在一些实施方式中，步骤2)和步骤3)的阴离子交换层析的缓冲液具有约5.0～约8.0的ph。在一些实施方式中，步骤2)的阴离子交换层析的缓冲液具有约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0的ph。

32、在一些实施方式中，步骤2)的阴离子交换层析的基质可以包括，但不限于nm90agarose ham、自poros hq、porosxq、q sepharosetm快流、deae sepharosetm快流、q、anx sepharosetm 4快流(高sub)、q sepharosetm xl、qsepharosetm大珠、deae sephadex a-25、deae sephadexa-50、qae sephadex a-25、qae sephadex a-50、qsepharosetm高性能、q sepharosetm xl、sourse 15q、sourse30q、resourse q、capto q、capto deae、mono q、toyopearl super q、toyopearl deae、toyopearl qae、toyopearl q、toyopearl gigacap q、ts凝胶superq、ts凝胶deae、fractogel emd tmae、fractogel emdtmae hicap、fractogel emd deae、fractogel emd dmae、macroprep high q、macro-prep-deae、unosphere q、nuvia q、porgspi、deae陶瓷hyperd、q陶瓷hyperd，或其任何组合。

33、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的洗脱缓冲液包含碱性氨基酸或其盐。在一些实施方式中，所述碱性氨基酸可以选自赖氨酸、精氨酸、组氨酸或其衍生物，或其任何组合。在一些实施方式中，所述碱性氨基酸的盐包括碱性氨基酸的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。

34、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析使用0～1.5m的碱性物质进行线性洗脱。

35、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的洗脱缓冲液包含0.1m～1.5m的碱性氨基酸或其盐。在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的洗脱缓冲液包含约0.1m、约0.2m、约0.3m、约0.4m、约0.5m、约0.6m、约0.7m、约0.8m、约0.9m、约1.0m、约1.1m、约1.2m、约1.3m、约1.4m或约1.5m的碱性氨基酸。

36、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的洗脱缓冲液不包含表面活性剂，例如聚山梨酯。

37、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的平衡缓冲液或洗脱缓冲液具有约5.0～约8.0的ph。在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的平衡缓冲液或洗脱缓冲液具有约5.0、约5.5、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5、约8.0的ph。

38、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的平衡缓冲液具有约70.0ms/cm以上的电导率。在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的平衡缓冲液具有约70.0ms/cm～约100.0ms/cm的电导率。在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的平衡缓冲液具有约75.0ms/cm、约80.0ms/cm、约85.0ms/cm、约90.0ms/cm、约95.0ms/cm或100.0ms/cm的电导率。

39、在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的基质可以为苯基、丁基、丙基、己基、辛基等基质。在一些实施方式中，步骤3)的疏水相互作用层析的基质可以包括，但并不限于hr butyl、hr phenyl、丁基sepharosetm、苯基sepharosetm等，或其任何组合。

40、通过本公开的疏水相互作用层析，能够明显提高洗脱的目的蛋白(特别是igm)的纯度，且使目的蛋白与聚集体和片段分离开。

41、在一些实施方式中，所述样品可以包括细胞培养物、腹水或血液提取物。

42、根据本公开的又一方面，提供了采用本公开的上述方法获得的经纯化的igm。

43、本公开的纯化igm的方法具有如下优势：

44、1、本公开采用阳离子交换层析(cex)进行捕获，避免使用亲和层析和羟基磷灰石，大大降低了生产成本。

45、2、cex捕获载量高，且明显高于亲和层析。

46、3、cex捕获的收率非常高，可以达到92％。

47、4、疏水层析也实现了显著去除聚集体的效果，降低了捕获步骤和阴离子流穿步骤对于聚集体控制的要求。

48、5.允许样品具有范围更广的ph值，对缓冲液无严格要求。相比之下，羟基磷灰石的使用ph范围是>6.5，对于低ph样品是不适用的。