抗人sCD14-ST蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及人分泌性scd14的诊断，特别涉及抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、人cd14蛋白分为膜型(mcd14)和分泌型(scd1)两类。mcd14在巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞中表达，其主要功能是作为细菌脂多糖(lps)和其他病原体相关分子的共受体。分泌型scd14也分为高分子量(49kd-55kd)scd14和低分子量(11kd-15kd)scd14-st两类。高分子量的scd14虽然广泛存在于败血症，艾滋及红斑狼疮等病人的血液中，但不是一个特异性的分子标记。scd14-st由高分子量的scd14的n端组成，并且c端氨基酸被大量删除。因此scd14-st和高分子量的scd14有着不同的免疫源性，可以被不同的抗体进行区分。研究发现，scd14-st可以作为败血症特异性的生物学指标，有潜在的生物学价值，从而引起临床高度重视。治疗败血症的共识是早期识别并给予有效的抗感染治疗。因此，开发高灵敏、特异性识别scd14-st抗体对败血症早期诊断具有重要意义。

技术实现思路

1、针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体，通过利用兔单b细胞抗体开发技术，从scd14-st免疫的兔外周血中，分离scd14-st特异性的单b细胞，通过pcr扩增及测序分析，获得多个特异性识别抗scd14-st蛋白的抗体。本发明筛选出的单克隆抗体，相比于采用传统杂交瘤技术筛选的抗体和兔多抗而言，亲和力和特异性更高；增加了抗scd14-st蛋白的抗体的多样性，为开发高灵敏度的scd14-st elisa诊断试剂盒奠定了坚实的基础。具体通过以下技术实现。

2、一种抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体，包括ab1、ab2、ab3、ab4、ab5、ab6的任一种；

3、ab1的重链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq idno.1-3所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列，ab1的轻链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.4-6所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；

4、ab2的重链可变区的3个互补决定区cdr1和cdr3的氨基酸序列如seq id no.7-8所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列，cdr2的氨基酸序列为stg或对其进行保守修饰的氨基酸序列；ab2的轻链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq idno.9-11所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；

5、ab1的重链可变区cdr3与ab2的重链可变区的cdr3的氨基酸序列相同。

6、ab3的重链可变区的3个互补决定区cdr1和cdr3的氨基酸序列如seq id no.12-13所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列，cdr2的氨基酸序列为ssd或对其进行保守修饰的氨基酸序列；ab3的轻链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq idno.14-16所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；

7、ab4的重链可变区的3个互补决定区cdr1的氨基酸序列如seq id no.17所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列，cdr2的氨基酸序列为dsg或对其进行保守修饰的氨基酸序列，cdr3的氨基酸序列为gdl或对其进行保守修饰的氨基酸序列；ab4的轻链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.18-20所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；

8、ab1的轻链可变区的cdr2与ab4的轻链可变区的cdr2的氨基酸序列相同。

9、ab5的重链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq idno.21-23所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列，ab5的轻链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.24-26所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列；

10、ab6的重链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq idno.27-29所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列，ab6的轻链可变区的3个互补决定区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.30-32所示或对其进行保守修饰的氨基酸序列。

11、ab5的重链可变区的cdr3与ab6的重链可变区的cdr3的氨基酸序列相同。ab5的轻链可变区的cdr3与ab6的轻链可变区的cdr3的氨基酸序列相同。

12、优选地地，所述抗体是兔单克隆或多克隆抗体或其片段。

13、优选地地，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。

14、优选地地，所述cdr之间具有47.4％-100％的同源性。

15、优选地，所述抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体，ab1的重链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.33-36所示，ab1的轻链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq idno.37-40所示；

16、ab2的重链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.41-44所示，ab2的轻链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.45-48所示；

17、ab3的重链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.49-52所示，ab3的轻链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.53-56所示；

18、ab4的重链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.57-60所示，ab4的轻链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.61-64所示；

19、ab5的重链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.65-68所示，ab5的轻链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.69-72所示；

20、ab6的重链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.73-76所示，ab6的轻链可变区的4个骨架区fr1、fr2、fr3和fr4的氨基酸序列如seq id no.77-80所示。

21、优选地，所述抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体，所述ab1的重链的氨基酸序列如seq id no.81所示，所述ab1的轻链的氨基酸序列如seq id no.82所示；

22、所述ab2的重链的氨基酸序列如seq id no.83所示，所述ab2的轻链的氨基酸序列如seq id no.84所示；

23、所述ab3的重链的氨基酸序列如seq id no.85所示，所述ab3的轻链的氨基酸序列如seq id no.86所示；

24、所述ab4的重链的氨基酸序列如seq id no.87所示；所述ab4的轻链的氨基酸序列如seq id no.88所示；

25、所述ab5的重链的氨基酸序列如seq id no.89所示，所述ab5的轻链的氨基酸序列如seq id no.90所示；

26、所述ab6的重链的氨基酸序列如seq id no.91所示，所述ab6的轻链的氨基酸序列如seq id no.92所示。

27、本技术中的“保守修饰”是指基本不影响原序列抗体特性的氨基酸修饰，包括氨基酸的突变、插入和缺失，具体修饰方式可以是本领域已知的修饰手段，如定点突变或pcr介导的诱变等。氨基酸的保守取代是指其氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。氨基酸残基家族为本领域公知定义，包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链氨基酸(如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链氨基酸(如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链氨基酸(如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸)，β支链侧链氨基酸(如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，cdr区的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基代替，并进行检测确保其保留原序列的功能。

28、本技术中的“保守修饰的变体”包括多肽序列的个别氨基酸被功能相似氨基酸取代、缺失或添加，还包括多态性变体、种间同系物及其等位基因。以下各组内氨基酸可以相互取代：(1)丙氨酸(a)，甘氨酸(g)；(2)天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；(3)天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；(4)精氨酸(r)，赖氨酸(k)；(5)异亮氨酸(i)，亮氨酸(l)，蛋氨酸(m)，缬氨酸(v)；(6)苯丙氨酸(f)，酪氨酸(y)，色氨酸(w)；(7)丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；(8)半胱氨酸(c)，蛋氨酸(m)。本技术中“保守序列修饰”指基本上不影响或改变其结合能力的氨基酸修饰。

29、优选地，所述抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体，还包括共价或非共价连接的偶联物。

30、优选地，所述fr之间具有55.6％-100％的同源性。

31、更优选地，所述抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体，所述偶联物包括酶、荧光蛋白、荧光团、生物素或链霉亲和素。

32、更优选地，所述酶包括hrp。

33、本发明还提供了上述的抗人scd14-st蛋白的单克隆抗体在制备人scd14-st蛋白的检测产品中的应用，所述检测产品为检测试纸条、检测试剂盒等。

34、一种人scd14-st蛋白的检测产品，包括上述任一项的抗人scd14-st单克隆抗体

35、优选地，所述检测产品为检测试纸条或检测试剂盒。

36、更优选地，所述检测试纸条为胶体金试纸条或elisa试纸条；所述检测试剂盒为胶体金检测试剂盒、elisa检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒、免疫层析试剂盒、磁颗粒检测试剂盒、化学发光检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或放射免疫检测试剂盒。

37、与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明针对人scd14-st蛋白，研究获得了一种兔抗人单克隆抗体，利用这种抗体或相应的检测试剂盒具有更高的特异性、亲和力和灵敏度，能精准定量地检测人scd14-st蛋白；能够在诊断和预后检测，以及在免疫学领域的人scd14-st蛋白动力学作用机制研究中发挥重要作用。