CAS12A核酸内切酶变体及使用方法与流程

背景技术：

1、原核生物已经发展出适应性免疫系统，称为成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)，其与cas蛋白缔合以构成适应性免疫系统，该适应性免疫系统可以对抗外来移动遗传元件诸如质粒和噬菌体的攻击。crispr-cas系统分为两类(1类和2类)，它们再细分为六种类型(i型至vi型)。1类(i、iii和iv型)系统在其crispr核糖核蛋白效应核酸酶中使用多种cas蛋白，而2类系统(ii、v和vi型)使用单一cas蛋白。2类v型进一步分为4个亚型(v-a、v-b、v-c、v-u)。目前，v-c和v-u仍未被广泛表征，也没有关于这些系统的结构信息。v-a编码蛋白cas12a(也称为cpf1)，最近cas12a的几个高分辨率结构提供了对其工作机制的深入了解。

2、2类v型crispr-cas 12a是一种rna引导的核酸内切酶，其已被用作基因组编辑工具。这些酶在基因和表观遗传编辑中的更广泛应用需要改进某些性质。

技术实现思路

0、发明概述

1、在一些方面，本公开提供了具有改善的性质(诸如超高活性(hyperactivity)和低的不加选择的单链dna降解活性)的变体cas12a核酸内切酶。野生型cas12a的广泛应用受到限制，部分原因是其相对于cas9而言具有较低的编辑效率以及其不加选择的单链dna降解活性。参与检查点进行准确靶识别的lid区域负责所有野生型cas12a直向同源物所展示的这种不加选择的ssdna降解活性。令人惊讶的是，本文描述的数据表明，对cas12a的lid区域的某些修饰不仅可以影响不加选择的单链脱氧核糖核酸酶(ssdnase)活性，还可以影响靶向切割活性-包括双链和单链切割活性。

2、在一些实施方案中，工程改造的变体核酸内切酶相对于其野生型参考cas12a核酸内切酶表现出更高效的切割活性。在其它实施方案中，本公开的工程改造的变体核酸内切酶表现出低至没有不加选择的单链dna酶活性。在一些实施方案中，本文还提供了表现出对双链dna中一条链的切割优先于对另一条链的切割的变体cas12a核酸内切酶。

3、根据lbcas12a nd2006核酸内切酶的结构研究，本技术人鉴定了一个特定的结构域，在本文中称为“lid-hub结构域”，其参与一个亚组的催化事件。例如，在位置k932、n933和v936进行的某些取代提高了切割效率(“超高活性”)，而在位置k932、n933、v936、q944、f983和m986进行的某些取代降低了不加选择的ssdna酶活性。lid和lid-hub结构域附近内的某些氨基酸取代也影响活性(例如v938或q941)。

4、此外，本技术人还出乎意料地显示，对lid稳定化电荷网络(根据其三维结构，定义为至少包括参考lbcas12a nd2006的氨基酸位置编号而言位置e835、r836、r935和/或k940)的修饰改变了cas12a切割偏好性(例如从双链dna切割活性)。

5、在一些实施方案中，变体cas12a核酸内切酶在lid区域内的一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸突变。例如，在一些实施方案中，变体cas12a核酸内切酶在对应于毛螺旋菌科(lachnospiraceae)细菌nd2006(例如seq id no：1)的位置925至937的氨基酸位置处包含一个或多个突变。在一些实施方案中，变体cas12a核酸内切酶在对应于毛螺旋菌科细菌coe1(例如seq id no：47)的位置936至948的氨基酸位置处包含一个或多个突变。

6、如本文中所述，术语“变体cas12a核酸内切酶”可与术语“cas12a变体”互换。

7、一些方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置e95、e125、n256、r747、h759、n813、k932、n933、s934、v936、s982或k984的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出超高活性(hyperactivity)。

8、其它方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置e95r、e95y、e125a、e125w、n256a、r747y、h759v、h759d、n813r、n813h、k932l、n933e、n933v、s934q、v936e、v936m、v936k、s982n或k984r的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出超高活性。

9、一些方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置n256、i831、k932、n933、s934、v936、q944、s982、f983、k984、m986或t988的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出过低活性。

10、其它方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置n256k、i831a、i831y、k932a、k932f、k932h、k932m、k932n、k932q、k932r、k932s、k932t、k932w、k932y、n933l、s934w、v936g、q944d、q944e、q944k、q944m、s982t、s982w、f983g、f983l、k984f、m986g、m986l、m986s或t988f的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出过低活性。

11、其它方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置：k932f和f983l、k932f和t988f、k932r和q944d、k932r和f983l、k932r和t988f、k932y和f983l、k932y和t988f、n933l和q944m、v936g和q944d、v936g和s982w、v936g和m986g、v936g和t988f、q944d和s982w、q944d和f983l、q944d和t988f、s982w和f983l；s982w和t988f或f983g和m986g的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出过低活性。

12、一些方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置n813、i831、k932、n933、s934、v936、q944、s982、f983、k984、m986或t988的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出低的(或无)ssdna酶活性，诸如低的(或无)不加选择的ssdna酶活性。

13、其它方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置n813h、n813r、n813w、i831a、i831y、k932a、k932f、k932h、k932m、k932n、k932q、k932r、k932s、k932t、k932w、k932y、n933e、n933l、s934k、s934q、v936e、v936g、q944d、q944e、q944k、s982w、f983g、f983l、k984f、m986f、m986g或t988f的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出低的(或无)ssdna酶活性，诸如低的(或无)不加选择的ssdna酶活性。

14、其它方面涉及工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含在对应于参考lbcas12and2006的氨基酸位置编号而言位置：n933l和q944m或f983g和m986g的氨基酸位置处具有突变的多肽序列。在一些实施方案中，前述变体cas12a核酸内切酶中的任一种或多种表现出低的(或无)ssdna酶活性，诸如低的(或无)不加选择的ssdna酶活性。

15、在一些实施方案中，工程改造的变体cas12a核酸内切酶与效应蛋白融合。

16、在一些实施方案中，本文提供的工程改造的变体cas12a核酸内切酶包含与选自酸氨球菌属的某一种(acidaminococcus sp.)、毛螺旋菌科的某一种(lachnospiraceae sp.)和弗朗西丝菌属的某一种(francisella sp.)的野生型cas12a核酸内切酶的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％但小于100％同一性的氨基酸序列。

17、在一些实施方案中，工程改造的变体cas12a核酸内切酶相对于野生型参考cas12a核酸内切酶还包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代。在一些实施方案中，变体cas12a核酸内切酶相对于野生型参考cas12a核酸内切酶还包含不超过5个额外的氨基酸取代。

18、本发明还提供了工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含含有seq id no：48-119和367-387中任一个或其直向同源物的氨基酸序列的多肽序列。

19、本文还提供了编码本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶的多核苷酸。

20、本文还提供了细胞，其包含(a)本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶或本公开的多核苷酸核酸内切酶，和(b)引导rna或编码引导rna的多核苷酸。

21、本文的一些方面涉及一种方法，该方法包括将(a)本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶或本公开的多核苷酸和任选地(b)引导rna或编码引导rna的多核苷酸引入细胞。

22、本公开还提供了本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶用于切割核酸的用途。

23、在一些实施方案中，用于在靶核酸中引入双链断裂的方法包括向包含靶核酸的细胞中引入(a)本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶和(b)引导rna，以及孵育所述细胞以在靶核酸中产生双链断裂。

24、在其它实施方案中，用于在靶核酸中引入双链断裂的方法包括向包含靶核酸的细胞中引入(a)本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶和(b)引导rna，以及孵育所述细胞以在靶核酸中产生双链断裂。

25、在一些实施方案中，所述细胞中的脱靶单链核酸切割相对于包含野生型cas12a核酸内切酶和引导rna的对照细胞中的脱靶单链核酸切割而言减少。

26、在一些实施方案中，用于在靶核酸中引入单链断裂的方法包括向包含靶核酸的细胞中引入(a)本公开的工程改造的变体cas12a核酸内切酶和(b)引导rna，以及孵育所述细胞以在靶核酸中产生单链断裂。

27、一些方面涉及包含seq id no：48-119和367-387中任一个的氨基酸序列或其变体的工程改造的多肽，所述变体与seq id no：48-119和367-387中的任一个氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，任选地，其中所述工程改造的多肽是相对于天然存在的cas12a核酸内切酶(例如seq idno：1)表现出超高活性、过低活性和/或低的ssdna酶活性(例如低的不加选择的ssdna酶活性)的核酸内切酶。

28、一些方面涉及融合蛋白，其包含前述方面或实施方案中任一项的工程改造的变体cas12a核酸内切酶和碱基编辑酶。

29、一些方面涉及包含seq id no：163-185和388-408中任一个的氨基酸序列或其变体的工程改造的多肽，所述变体与seq id no：163-185和388-408中任一个的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。

30、其它方面涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含工程改造的变体cas12a核酸内切酶，其包含与seq id no：367-387中任一个的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

31、在一些实施方案中，碱基编辑酶能够将嘌呤转化为不同的嘌呤或将嘧啶转化为不同的嘧啶。

32、在一些实施方案中，碱基编辑酶包括脱氨酶、鸟嘌呤氧化酶或鸟嘌呤甲基转移酶。

33、在一些实施方案中，脱氨酶是胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶。

34、在一些实施方案中，脱氨酶包含rapobec1多肽、evoapobec1多肽、hapobec3a多肽、evocda多肽、evoferny多肽或tada多肽。

35、在一些实施方案中，融合蛋白还包含尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)。

36、在一些实施方案中，融合蛋白还包含一个或多个核定位信号(nls)，其任选地选自sv40 nls、核蛋白(np)nls和二分(bipartite,bp)nls。

37、在一些实施方案中，融合蛋白还包含尿嘧啶dna糖基化酶(ung)，任选地为人ung(hung)或大肠杆菌(escherichia coli)ung(eung)。

38、在一些实施方案中，融合蛋白还包含n-甲基嘌呤糖基化酶(mpg)，任选地，其中mpg位于融合蛋白的n末端或c末端或其附近。

39、在一些实施方案中，融合蛋白还包含一个或多个接头。

40、在一些实施方案中，接头包含sgsetpgtsesatpes(seq id no：203)的序列。

41、在一些实施方案中，接头包含sggssggssgsetpgtsesatpessggssggs(seq id no：204)的序列。

42、在一些实施方案中，融合蛋白还包含dna结合结构域(dbd)。

43、在一些实施方案中，dbd是rad51 dbd。

44、一些方面涉及编码前述方面或实施方案中任一项的融合蛋白的多核苷酸。

45、其它方面涉及细胞，其包含：含有靶链和非靶链的靶核酸；引导rna(grna)或编码与靶链结合的grna的核酸；以及前述方面或实施方案中任一项的融合蛋白或前述方面或实施方案中任一项的多核苷酸。

46、在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。

47、在一些实施方案中，所述人细胞来自人受试者，其中所述人受试者患有与所述靶核酸相关的疾病、病症或疾患。

48、在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞。

49、一些方面涉及方法，所述方法包括向细胞中引入(a)前述方面或实施方案中任一项的融合蛋白或前述方面或实施方案中任一项的多核苷酸，以及任选的(b)引导rna或编码引导rna的多核苷酸。

50、一些方面涉及基因编辑的方法，其包括(i)使靶核酸序列与前述方面或实施方案中任一项的融合蛋白和引导rna接触，其中所述靶核酸包含靶核碱基；和(ii)修饰所述靶核碱基。

51、在一些实施方案中，所述靶核酸是靶双链dna核酸。

52、在一些实施方案中，引导rna指导融合蛋白结合所述靶核酸的特定区段并接近所述靶核碱基。

53、在一些实施方案中，融合蛋白切割所述靶核酸。

54、在一些实施方案中，融合蛋白包含胞苷脱氨酶，并且所述靶核碱基是胞苷。在一些实施方案中，融合蛋白包含鸟嘌呤氧化酶，并且所述靶核碱基是鸟苷。在一些实施方案中，融合蛋白包含鸟嘌呤甲基转移酶，并且所述靶核碱基是鸟苷。

55、在一些实施方案中，所述方法在细胞中进行，任选地在人细胞或植物细胞中进行。

56、在一些实施方案中，所述方法在体外进行或离体进行。在其它实施方案中，所述方法在体内进行。

57、在一些实施方案中，所述靶核酸是相对于野生型基因包含核碱基突变的基因。

58、在一些实施方案中，所述包含核碱基突变的基因与疾病或病症相关。