纳米铁修饰的重组芽孢杆菌粉剂的制备及其在降低稻田砷镉有效性的应用

本发明涉及遗传工程及材料，具体涉及一种来源于棘孢木霉的具有砷、镉固定能力的蛋白，还涉及编码所述蛋白的基因、含有所述基因的载体、基因工程菌株及其应用；还涉及一种经纳米铁基材料修饰的、具有砷、镉固定蛋白基因的芽孢杆菌b12，及其在抗镉砷污染中的应用。

背景技术：

1、近年来，砷镉共同污染问题的治理逐渐得到人们的关注。有些修复技术如植物修复、钝化、淋洗等修复技术在一定程度上可降低土壤中砷或镉的环境风险，但从长远来看，经济投入大，修复时间长，过度修复等问题会对土壤结构与肥力等造成负面影响，不利于农业发展的可持续性。微生物材料作为一种新型的砷镉污染修复材料，在新陈代谢的过程中介导砷镉的累积与转化，但是单一微生物修复通常弊无利化学需要更长的时间，利用化学材料修饰微生物被日渐关注。

2、

3、例如中国发明专利申请cn 112358880 a公开了一种微生物纳米材料复合菌剂及其制备方法与应用。将铁基纳米材料和镁基纳米材料与微生物进行化学耦合，开发新一代纳米材料@微生物复合材料。如前所述，该技术属于生物淋洗剂，对土壤结构与肥力等造成负面影响。另一方面，本发明人经实验发现，该淋洗剂未能实际起到固定土壤中砷镉的作用，在苗期实验中，未体现其降低作物体内重金属含量的效果。

4、因此，应用固定化微生物到砷镉污染水体或土壤的修复中，以提升效率、降低成本依然具有发展潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有微生物材料施用缺陷，提供一种新的经过纳米修饰的具有砷、镉固定蛋白的重组菌株，通过实验以确定该工程菌株对砷、镉具有优秀的固定作用，以期降低培养环境中的砷镉含量。

2、为了实现上述目的，本发明提供砷、镉固定蛋白b12，所述蛋白来源于棘孢木霉，所述蛋白的编码基因的核酸序列如seq idno.1所示。

3、本发明还验证了上述砷、镉固定蛋白b12在提高芽孢杆菌对镉和砷的抗性中的应用。

4、进一步地，本发明提供表达上述砷、镉固定蛋白b12基因的工程菌株。

5、作为一种优选的实施方式，所述菌株是重组芽孢杆菌。

6、本发明还验证了所述工程菌株在抗cd(ii)和as(iii)中的应用。

7、基于此，本发明还提供含有上述工程菌株的粉剂。

8、特别地，本发明还提供一种纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌b12@nfe粉剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

9、（1）构建重组芽孢杆菌b12@nfe

10、以棘孢木霉 trichoderma asperellum sm-12f1基因为模板，扩增得到砷、镉固定蛋白b12基因，其核酸序列如seq idno.1所示，所得基因片段与线性质粒pp43nmk进行连接，转化至感受态大肠杆菌  escherichia coli jm109 中，挑取转化子并验证正确后，提取质粒pp43nmk-b12；

11、将质粒pp43nmk- b12转化至感受态枯草芽孢杆菌 bacillus subtilis，挑取转化子并经过pcr和酶切质粒验证正确，获得编码b12蛋白基因表达的重组枯草芽孢杆菌b12；

12、（2）制备纳米铁基富硫材料

13、称取8.5 g fecl3·6h2o和 3.0 g feso4·7h2o，溶解到38ml的0.4m的盐酸溶液中，加入3.6g caso4·2h2o，搅拌至充分溶解得到混合液；

14、在强烈机械搅拌条件下将混合液加入到375ml的0.7m氨水溶液中，生成fe3o4胶状沉淀，然后添加2ml硅有机化合物si(oc2h5)4，充分搅拌后静置沉淀，待完全沉淀后倒出上清液，所得沉淀物用超纯水洗涤后得到含钙、硅、硫的fe3o4纳米颗粒；

15、将所得纳米颗粒分散于超纯水130 ml中得到悬浮液，取30 ml该悬浮液，加入正丙醇溶液300 ml，超声处理以消除cl-、nh4+等离子的影响，然后在搅拌下加入5.0g聚乙二醇、30 ml超纯水、15 ml氨水，室温下持续搅拌以防止材料团结，搅拌完成后静置至完全沉淀，所得沉淀用超纯水洗涤后经过离心分离，然后冷冻干燥得到均匀分散的磁性纳米粒子nfe；

16、将所述磁性纳米粒子nfe分别研磨为80纳米和150纳米粒径的材料，按质量比1：2复配80纳米和150纳米粒径的材料，得到纳米铁基富硫材料。

17、（3）制备纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌b12@nfe粉剂

18、将步骤（1）的重组枯草芽孢杆菌b12在含有20 mg·l-1 kana的lb固体培养基中静止培养3天，挑取阳性单克隆于含有20 mg·l-1 kana的lb液体培养基培养过夜后，按1%的接种量接种到lb液体培养基中，待od600值为0.6-0.8时，离心除去上清液，菌沉淀后用灭菌水清洗，然后重悬于等体积的灭菌水中得到菌液；

19、将步骤（2）得到的纳米铁基富硫材料0.1g加入到10ml菌液中，在30℃、200rpm振荡培养1h后，离心弃去上清液后，用超纯水清洗后将沉淀置于冷冻干燥机中干燥到干粉状态，得到纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌b12@nfe粉剂。

20、本发明还验证了上述制备方法得到的纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌b12@nfe粉剂在降低水稻中镉和砷含量中的应用。

21、作为一种优选的实施方式，将所述粉剂添加到土壤中，添加量为以土壤质量百分比计≥0.3%。

22、本发明经实验验证上述砷、镉固定蛋白b12能够提高菌株对环境中的镉和砷的抗性。本发明还通过实验验证了表达该砷、镉固定蛋白b12基因的重组芽孢杆菌对土壤中cd(ii)和as(iii)的固定作用，说明该重组菌在砷镉共同污染环境中可应用与降低重金属污染的修复。

23、本发明首次构建对砷镉共同污染有结合效果的天然纳米材料修饰的基因工程菌，为南方水稻田和水体环境中的砷镉污染修复提供了一种新的生物化学修复材料与技术。

技术特征：

1.砷、镉固定蛋白b12，所述蛋白来源于棘孢木霉，所述蛋白的编码基因的核酸序列如seq idno.1所示。

2.权利要求1所述的砷、镉固定蛋白b12在提高芽孢杆菌对镉和砷的抗性中的应用。

3.表达权利要求1所述砷、镉固定蛋白b12基因的工程菌株。

4.根据权利要求3所述的工程菌株，其特征在于所述菌株是重组芽孢杆菌。

5.权利要求3所述的工程菌株在抗cd(ii)和as(iii)中的应用。

6.含有权利要求4所述工程菌株的粉剂。

7.纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌b12@nfe粉剂的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述制备方法得到的纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌b12@nfe粉剂在降低水稻中镉和砷含量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将所述粉剂添加到土壤中，添加量为以土壤质量百分比计≥0.3%。

技术总结本发明提供砷、镉固定蛋白B12。本发明提供表达上述砷、镉固定蛋白B12基因的工程菌株，还提供纳米铁基材料修饰的重组芽孢杆菌B12@nFe粉剂的制备方法。本发明验证了上述砷、镉固定蛋白B12能够提高菌株对环境中的镉和砷的抗性，以及表达该砷、镉固定蛋白B12基因的重组芽孢杆菌对土壤中Cd(II)和As(III)的固定作用，说明该重组菌在砷镉共同污染环境中可应用与降低重金属污染的修复。本发明的纳米铁基富硫材料修饰的重组菌B12@nFe粉剂在水稻‑砷镉污染土壤体系中能显著降低水稻内砷镉含量，表明该粉剂具有固定土壤中砷镉的能力，对稻田砷镉复合污染修复表现出巨大潜力。技术研发人员：苏世鸣,王婷娟,李丽娟,曾希柏,张洋,张楠,何超受保护的技术使用者：中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所技术研发日：技术公布日：2024/10/10