一种抗CLDN18.2的纳米抗体及其用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗cldn18.2的纳米抗体及其用途。

背景技术：

1、claudin(cldn)蛋白是紧密连接(tight junction)分子，它的功能主要是调节屏障结构的渗透性。在人体的生命活动中，紧密连接起着重要的作用。一方面，紧密连接可以行使“屏障”的功能，对物质的大小和电荷进行选择，进而调控细胞旁途径的物质转运。例如，脑血管内皮细胞可以通过这道屏障，阻止血液与脑细胞外液相混。另一方面，紧密连接还可以行使“栅栏”的功能，通过调控顶膜和基底侧膜两个功能区之间的脂质和蛋白等物质的自由弥散，维持细胞的极性。claudin蛋白是一种分子量约20～27kda的四次跨膜蛋白，c端和n端都凸向细胞质侧，另外还有两个细胞外结构域ecl1和ecl2。研究发现，在上皮细胞或内皮细胞间，紧密连接中claudin蛋白多以其亚型的形式存在，紧密连接的渗透性由不同的claudin蛋白亚型之间的相互作用来调节。claudin家族包含至少27个成员，其中claudin18.2(cldn18.2)是claudin蛋白家族中的一员，它是一种具有高度组织表达特异性的跨膜蛋白，在正常组织中表达水平非常低，但在非恶性胃粘膜中高度选择性表达，与在邻近细胞表面表达的claudin18.2-分子结合构成紧密连接复合体，形成选择性可渗透屏障，实现组织特异性渗透。这种紧密连接蛋白在恶性转化过程中会暴露在肿瘤细胞表面上，使其成为靶向癌症治疗的一个可接触的靶标。现有研究发现，在正常生理状态下，claudin 18.2仅在胃粘膜上已分化的上皮细胞中表达，而在其它的健康组织中均无表达。但在胃肠道肿瘤如胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠腺癌，以及肺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌等多种肿瘤中，claudin18.2却呈现高表达的现象。肿瘤细胞极性的紊乱可导致细胞表面claudin 18.2蛋白表位暴露，并出现异常激活。这一正常组织局限性表达而肿瘤中特异性高表达的特点使claudin18.2成为了理想的实体瘤治疗靶点。目前有多款cldn18.2为靶点的药物进入临床阶段，单克隆抗体、adc、双特异性抗体和car-t疗法在cldn18.2阳性胃癌和胰腺癌人群中表现出了良好的安全性和有效性。虽然claudin 18.2在实体瘤靶向疗法开发领域具有潜力，但该领域的研究仍处于起步阶段，国内尚未有该靶点的药物上市。

2、发现和制备具有改进的亲和力和更强抗肿瘤活性的新型cldn18.2抗体，能进一步提高疗效，将cldn18.2靶向治疗的益处扩展到那些靶标表达水平较低的患者，具有广泛的临床应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种靶向cldn18.2的纳米抗体及其在肿瘤靶向治疗中的用途。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为实现上述目的，本发明首先提供了靶向cldn18.2的纳米抗体，所述纳米抗体包含选自a1)或a2)的互补决定区：

3、a1)氨基酸序列分别是seq id no.2的第26-32位的互补决定区cdr1、seq id no.2的第50-59位的互补决定区cdr2和seq id no.2的第98-111位的互补决定区cdr3；

4、a2)氨基酸序列分别是seq id no.4的第26-32位的互补决定区cdr1、seq id no.4的第50-59位的互补决定区cdr2和seq id no.4的第98-111位的互补决定区cdr3。

5、含有a1)所示互补决定区的纳米抗体名称可为cldn18.2-vhh-319。含有a2)所示互补决定区的纳米抗体名称可为cldn18.2-vhh-357。

6、所述互补决定区(cdr)的序列根据kabat编号系统定义。

7、所述纳米抗体(也称为单域抗体)只有重链抗体的可变区(vhh)，依次由框架区fr1、互补决定区cdr1、框架区fr2、互补决定区cdr2、框架区fr3、互补决定区cdr3和框架区fr4组成。

8、进一步地，所述纳米抗体的氨基酸序列可为下述任一种：

9、b1)seq id no.2，或与seq id no.2相比具有80％以上同一性的氨基酸序列，或与seq id no.2相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；

10、b2)seq id no.4，或与seq id no.4相比具有80％以上同一性的氨基酸序列，或与seq id no.4相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；

11、b3)在b1)或b2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的氨基酸序列。

12、进一步地，所述置换可为保守置换。

13、进一步地，氨基酸序列的不一致处可在框架区(fr)，例如在框架区中具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加。

14、所述框架区(framework region，fr)为本领域已知的，是指可变区中除了cdr以外的区域，包括fr1、fr2、fr3和fr4。

15、所述几个可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。

16、b3)中所述连接可通过肽键(peptide bond)直接连接，或通过接头连接。

17、b3)所示的纳米抗体可为融合了标签或信号肽且功能不变的纳米抗体。

18、为了使b1)或b2)所示纳米抗体便于分离、纯化、检测和/或定位，可在由序列表中seq id no.2或seq id no.4所示的氨基酸序列组成的纳米抗体的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

19、所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、trx(硫氧还蛋白)标签蛋白、氮利用底物a(nusa)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha(流感血凝素)标签蛋白、myc标签蛋白、lacz标签蛋白、cbd(纤维素结合域)标签蛋白、噬菌体t7蛋白激酶(t7pk)标签蛋白、gfp(绿色荧光蛋白)、cfp(青色荧光蛋白)、yfp(黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。本领域技术人员已知如何根据期望目的选择合适的标签蛋白。标签的使用不改变目的蛋白(纳米抗体)的功能，其目的在于分离、纯化、检测或示踪，因此适用于本技术的标签蛋白并不局限于特定种类。标签可以通过本领域已知的化学裂解法或酶法(如引入蛋白酶切位点利用tev蛋白酶切割去除标签)与目的蛋白(纳米抗体)进行分离。

20、本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

21、c1)编码本文中任一所述纳米抗体的核酸分子；

22、c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；

23、c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体；

24、c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物；

25、c5)含有c1)所述核酸分子的重组宿主细胞。

26、所述生物材料均可表达本文中任一所述纳米抗体。

27、进一步地，所述重组载体可为将编码本文中任一所述纳米抗体的核酸分子(如seqid no.1或seq id no.3所示的dna分子)克隆到表达载体中得到的重组表达载体。虽然本发明提供的实施例利用的表达载体是哺乳动物表达载体pcag-fc，但本发明不限于该特定载体。本领域技术人员可采用其它合适的载体，只要该载体能够克隆或表达编码本文中任一所述纳米抗体的核酸分子即可。

28、进一步地，所述表达载体可选自原核表达载体(包括大肠杆菌(如bl21系列表达细胞、m15表达细胞、top10表达细胞和origamai系列表达细胞)表达载体但不限于此)和真核表达载体(包括酵母(如x33细胞、gs115细胞和smd1168细胞)表达载体、昆虫细胞(如sf21细胞、sf-9细胞和hi-5细胞)表达载体、哺乳动物细胞(如het293细胞和cho细胞)表达载体但不限于此)。

29、上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：

30、d1)编码序列或核苷酸序列是seq id no.1的dna分子；

31、d2)编码序列或核苷酸序列是seq id no.3的dna分子；

32、d3)与seq id no.1限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码氨基酸序列是seq id no.2的纳米抗体的dna分子；

33、d4)与seq id no.3限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码氨基酸序列是seq id no.4的纳米抗体的dna分子。

34、seq id no.1所示的dna分子编码氨基酸序列为seq id no.2的纳米抗体cldn18.2-vhh-319。seq id no.3所示的dna分子编码氨基酸序列为seq id no.4的纳米抗体cldn18.2-vhh-357。

35、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定点突变(包括寡核苷酸引物介导的定点突变、pcr介导的定点突变和盒式突变等)或定向进化(包括易错pcr、dna改组和体外随机引发重组等)的方法，对本发明的编码本文中任一所述纳米抗体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工改造的、与本发明编码本文中任一所述纳米抗体的核苷酸序列(如seq id no.1或seq id no.3)具有75％以上同一性的核苷酸序列，只要编码本文中任一所述纳米抗体且具有与本文中任一所述纳米抗体相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

36、本文所述核酸分子还可包括在seq id no.1或seq id no.3所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

37、与本文任一所述纳米抗体的序列具有改善的亲和力和/或效价的变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的保护范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。

38、在某些实施方案中，可以在本发明任一所述纳米抗体的一个或多个互补决定区或框架区内发生替代、插入或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对互补决定区和/或框架区做出保守变化(例如，保守替代，本领域技术人员所熟知，氨基酸的保守性取代不改变蛋白质的性质和功能)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在互补决定区中的抗原接触残基以外。

39、本发明还提供了本文中任一所述纳米抗体或所述生物材料在下述任一项中的用途：

40、e1)在制备用于预防或治疗肿瘤的产品中的用途；

41、e2)在制备用于预防或治疗claudin 18.2靶点相关疾病的产品中的用途；

42、e3)在制备用于筛查、诊断或辅助诊断claudin 18.2靶点相关疾病的产品中的用途；

43、e4)在制备用于检测claudin 18.2蛋白或表达claudin 18.2的细胞的产品中的用途；

44、e5)在制备用于结合claudin 18.2蛋白的产品中的用途；

45、e6)在制备介导药物特异性地识别表达claudin 18.2抗原的肿瘤的产品中的用途；

46、e7)在制备用于claudin 18.2蛋白的体内显像的产品中的用途；

47、e8)在制备靶向claudin 18.2的双特异性抗体、多特异性抗体、抗体药物偶联物或car细胞中的用途。

48、上述用途中，所述肿瘤或claudin 18.2靶点相关疾病可为claudin18.2阳性肿瘤。

49、进一步地，所述claudin18.2阳性肿瘤可为claudin18.2阳性实体肿瘤。进一步地，所述claudin18.2阳性实体肿瘤可为claudin18.2阳性消化系统肿瘤。

50、进一步地，所述claudin18.2阳性肿瘤可为claudin18.2阳性癌症，也可为claudin18.2阳性的间皮瘤。

51、进一步地，所述癌症可选自胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、支气管癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、胆囊癌、胆管癌和胃食管交界处(gej)腺癌。

52、进一步地，所述癌症包括早期癌症、中期癌症、中晚期癌症、晚期癌症、复发性癌症、转移性癌症等。

53、claudin 18.2在正常组织与肿瘤组织表达差异，参与肿瘤的发生和发展，位于细胞外膜，使其成为一种选择性高的细胞谱系标记物。e3)所述用途可包括基于抗原抗体特异性反应原理，利用本发明所述纳米抗体检测claudin 18.2蛋白表达，进而用于claudin18.2靶点相关疾病的筛查和诊断(包括预后诊断，如预测患者死亡几率、评估疾病危险分层等)。例如，可将本文中任一所述纳米抗体制备成免疫组化试剂盒，用于筛查或诊断claudin-18.2阳性肿瘤患者，并进一步指导用药及治疗。

54、e4)中所述检测claudin 18.2蛋白或表达claudin 18.2的细胞包括基于抗原抗体特异性反应原理的任何体内或体外的claudin 18.2蛋白的检测。所述检测claudin 18.2蛋白可为检测待测样品中是否含有claudin 18.2蛋白和/或检测待测样品中claudin 18.2蛋白的含量。所述表达claudin 18.2的细胞进一步可为表达claudin 18.2的肿瘤细胞。

55、e5)中所述结合claudin 18.2蛋白的产品可以是claudin 18.2蛋白抑制剂，也可以是用于分离claudin 18.2蛋白的产品但不限于此。例如可将本发明所述纳米抗体制备成免疫亲和层析柱，基于抗原经过层析柱时可被抗体捕获、改变ph值等环境条件使抗原从中解离的原理，筛选分离出claudin 18.2蛋白。

56、e6)中所述介导药物特异性地识别表达claudin 18.2抗原的肿瘤的产品可为特异性靶向claudin 18.2蛋白的载药系统，所述载药系统可含有本文中任一所述纳米抗体或其组合。所述载药系统可为脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统、纳米粒递药系统、乳剂递药系统或细胞膜纳米囊泡递药系统。所述载药系统可用于药物的靶向运输和/或定点释放。

57、e7)中所述用于claudin 18.2蛋白的体内显像的产品可包括显像剂、造影剂、示踪剂等，所述产品可用于免疫成像技术。例如将本发明所述的纳米抗体与具有成像功能的分子(包括但不限于放射性核素、近红外染料、荧光素酶、磁共振成像的纳米粒子、磁共振成像的量子点)偶联，注入患者体内后，基于纳米抗体的靶向功能，可自行到达相应组织部位，进行免疫显像，即实现针对claudin 18.2蛋白的活体成像。

58、e8)中所述靶向claudin 18.2的双特异性抗体、多特异性抗体、抗体药物偶联物或car细胞含有本文中任一所述纳米抗体。

59、本领域已知多种不同的双特异性抗体或多特异性抗体结构，基于纳米抗体构建双特异性抗体、多特异性抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，利用铰链区或linker将本发明任一所述纳米抗体(作为第一抗体)与一个或一个以上的其他抗体(可以是针对不同靶标的其他抗体，也可以是针对claudin 18.2靶标的不同表位的其他抗体)连接，构建出双特异性抗体或多特异性抗体。其他抗体可以单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体(包括嵌合抗体、cdr移植抗体和sdr移植抗体)以及全人抗体。其他抗体不仅包括完整抗体，而且包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段(例如fab、fab′、f(ab′)2、fv、单链抗体(scfv)、单域抗体(sdab，即纳米抗体)和最小识别单位(mru)等)。

60、最小的双特异抗体可由linker(连接肽)将两个纳米抗体分子头尾相连，如利用本发明的纳米抗体cldn18.2-vhh-319和cldn18.2-vhh-357构建出靶向claudin 18.2不同表位的双特异性纳米抗体。也可利用本发明任一所述纳米抗体和第二纳米抗体构建出靶向不同靶标的双特异性纳米抗体。

61、e8)中所述的car细胞含有和/或表达嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体含有本文中任一所述纳米抗体。所述car细胞可包括car-t细胞、car-nk细胞、car-nkt细胞、car-γδt细胞、car-巨噬细胞(car-m细胞)、car-ipsc细胞和car-psc细胞等但不限于此。

62、本发明还提供了双特异性抗体或多特异性抗体，所述双特异性抗体或多特异性抗体包含本文中任一所述的纳米抗体。

63、进一步地，所述双特异性抗体还含有第二抗体。所述多特异性抗体还含有两个以上的其他抗体。所述第二抗体或其他抗体可以是针对不同靶标(不同于claudin 18.2靶标的其他靶标，如cd3、4-1bb、pd-l1、cd47、her2、muc1、cd16和b7h3等)的抗体，也可以是针对claudin 18.2靶标的不同表位的抗体。

64、所述第二抗体或其他抗体可以单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体(包括嵌合抗体、cdr移植抗体和sdr移植抗体)以及全人抗体。所述第二抗体或其他抗体不仅包括完整抗体，而且包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段(例如fab、fab′、f(ab′)2、fv、单链抗体(scfv)、单域抗体(sdab，即纳米抗体)和最小识别单位(mru)等)。所述第二抗体或其他抗体可以与所述第一抗体直接连接或通过接头连接。

65、进一步地，所述接头(linker)可为柔性肽接头，例如包括甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或赖氨酸残基的肽接头。所述肽接头可由1-40个氨基酸组成。进一步地，所述接头(linker)包括但不限于：(g)n、(s)n、(gxs)n、(sxg)n、(gssgg)n、(ggsgg)n、(gsggsg)n、(gsgsgs)n、(ggqgg)n、(eaaak)n和iegrmd，以及它们的各种组合。其中：n可以是1-10之间的任何整数；x可以是1-6之间的任何整数。

66、进一步地，所述双特异性抗体可以是含有纳米抗体cldn18.2-vhh-319和cldn18.2-vhh-357的双特异性纳米抗体。

67、进一步地，本发明还提供了所述双特异性抗体或多特异性抗体的制备方法，所述方法包括构建含有所述双特异性抗体或多特异性抗体基因的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得重组宿主细胞；培养所述重组宿主细胞，经分离纯化获得所述双特异性抗体或多特异性抗体。

68、本发明还提供了抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，所述抗体部分包含本文中任一所述的纳米抗体。

69、进一步地，所述抗体部分和偶联部分可直接连接，或通过接头(如腙键、二硫键、硫醚键、肽键)共价连接。

70、进一步地，所述偶联部分选自化学药物、细胞毒素和可检测的标记。

71、进一步地，所述化学药物可以是预防或治疗疾病的化学药物，包括化疗药物、抗肿瘤药物、抗炎药物等，例如细胞因子、凋亡诱导剂(bcl-xl抑制剂)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶(nampt)抑制剂、抗肿瘤抗生素、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗代谢药物、硼药、烷化剂、激素和抗激素类药物、皮质类固醇、光动力治疗药物等。

72、进一步地，所述细胞毒素可以是抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的物质，包括微管蛋白抑制剂(如美登素、阿里他汀(mmae和mmaf))、dna损伤剂(如卡奇霉素、杜卡霉素、喜树碱、倍癌毒素)、rna合成抑制剂(如鹅膏毒素、泰兰司他丁及其类似物)或蛋白质合成抑制剂(如蓖麻毒素)。

73、所述可检测的标记包括酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物)、荧光染料(如amca、fitc、pe、pi、percp-cy5.5、pe-cy7、apc、apc-h7、bv421、v500、alexa 700、bv605)、近红外染料(如菁类染料、bodipy类、罗丹明类、方酸类、卟啉类染料)、放射性核素(如124i、18f、11c、99mtc、123i)、生物素、磁共振成像的纳米粒子、磁共振成像的量子点、磁性物质(如磁珠、含钆复合物的纳米颗粒、超顺磁性氧化铁纳米颗粒)和胶体金等但不限于此。

74、本发明还提供了用于预防或治疗claudin 18.2靶点相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包括本文中任一所述的纳米抗体、所述生物材料、所述双特异性抗体或多特异性抗体或所述抗体偶联物，以及一种或多种药学上可接受的载体。

75、所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、防腐剂、稳定剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂、润滑剂、烟雾化剂、悬浮剂、增塑剂和分散剂。

76、所述药物组合物的剂型可包括吸入制剂、口服制剂和注射制剂但不限于此。所述吸入制剂可为吸入气雾剂、吸入粉雾剂、吸入喷雾剂、吸入液体制剂、吸入雾化剂、吸入用冻干粉针剂或鼻喷剂。所述口服制剂可为片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、固体饮料或口服液。所述注射制剂可为注射液或注射用粉针剂。

77、为了将所述药物组合物制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂(载体)，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油等载体，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等载体。

78、本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒含有本文中任一所述的纳米抗体或所述双特异性抗体或多特异性抗体。

79、所述试剂盒可具有下述任一用途：

80、(1)筛查、诊断或辅助诊断claudin 18.2靶点相关疾病；

81、(2)检测claudin 18.2蛋白或表达claudin 18.2的细胞；

82、(3)结合claudin 18.2蛋白(如分离或纯化)；

83、(4)用于claudin 18.2蛋白的体内显像。

84、进一步地，所述试剂盒可用于检测表达claudin 18.2的肿瘤细胞，或用于检测claudin 18.2阳性癌症是否存在于受试者中。

85、所述试剂盒的检测样本可为血液样本(如全血、血浆、血清)、组织样本、细胞样本等但不限于此。

86、所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、免疫沉淀检测试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒但不限于此。

87、进一步地，所述试剂盒还可包括免疫检测所需试剂，如标记抗体或抗原、磁微粒、封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液等但不限于此。

88、本发明还提供了检测claudin 18.2蛋白的方法，所述方法包括使用本文中任一所述的纳米抗体、所述双特异性抗体或多特异性抗体或所述试剂盒检测claudin 18.2蛋白。

89、所述检测可包括检测样品中是否存在claudin 18.2蛋白，或样品中claudin 18.2蛋白的表达水平或含量。所述样品可为来自受试者的细胞样品、组织样品或血液样品等，也可以是受试者。所述检测不仅包括体外检测，也包括体内检测。

90、进一步地，所述检测claudin 18.2蛋白的方法包括使本文中任一所述的纳米抗体、所述双特异性抗体或多特异性抗体或所述试剂盒与待测样品接触，通过抗原抗体反应来检测待测样品中是否存在claudin 18.2蛋白。

91、进一步地，所述检测claudin 18.2蛋白的方法包括先将本文中任一所述的纳米抗体或所述双特异性抗体或多特异性抗体用可检测物质进行标记；再使其与待测样品接触，通过对可检测物质的检测来检测待测样品中是否存在claudin 18.2蛋白，或待测样品中claudin 18.2蛋白的含量。

92、进一步地，所述可检测物质可选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物)、荧光染料(如amca、fitc、pe、pi、percp-cy5.5、pe-cy7、apc、apc-h7、bv421、v500、alexa700、bv605)、近红外染料(如菁类染料、bodipy类、罗丹明类、方酸类、卟啉类染料)、放射性核素(如124i、18f、11c、99mtc、123i)、生物素、磁共振成像的纳米粒子、磁共振成像的量子点、磁性物质(如磁珠、含钆复合物的纳米颗粒、超顺磁性氧化铁纳米颗粒)和胶体金等但不限于此。

93、所述检测claudin 18.2蛋白的方法可以是免疫学检测，例如沉淀反应、凝集试验、免疫印迹法、酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、放射免疫测定法(ria)、胶体金免疫技术(gic)、胶体金免疫层析技术(gica)、免疫组织化学法、补体结合反应法、多元免疫分析法和荧光免疫层析技术。

94、所述检测claudin 18.2蛋白的方法可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的。

95、本发明还提供了本文中任一所述纳米抗体的制备方法，所述制备方法包括在宿主细胞中表达本文中任一所述纳米抗体，并回收或分离所述纳米抗体。

96、进一步地，所述制备方法可包括如下步骤：构建含有编码所述纳米抗体的核酸分子的重组表达载体；将所述重组表达载体导入宿主细胞，获得表达所述纳米抗体的重组宿主细胞；培养所述重组细胞，从培养的重组宿主细胞培养物中回收或分离所述纳米抗体。

97、进一步地，所述编码所述纳米抗体的核酸分子可为下述任一种：

98、(1)编码序列或核苷酸序列是seq id no.1的dna分子；

99、(2)编码序列或核苷酸序列是seq id no.3的dna分子；

100、(3)与seq id no.1限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码氨基酸序列是seq id no.2的纳米抗体的dna分子；

101、(4)与seq id no.3限定的核苷酸序列具有75％以上同一性，且编码氨基酸序列是seq id no.4的纳米抗体的dna分子。

102、进一步地，所述回收或分离可通过沉淀法(如盐析法、有机溶剂沉淀法、辛酸-饱和硫酸铵沉淀法、等电点沉淀法)或层析技术(如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析)从培养物(包括培养容器内的所有物质)中分离。

103、本发明还提供了预防或治疗claudin 18.2靶点相关疾病的方法，所述方法包括向患有claudin 18.2靶点相关疾病的受试者施用本文中任一所述的纳米抗体、所述生物材料、所述双特异性抗体或多特异性抗体、所述抗体偶联物或所述药物组合物。

104、进一步地，所述施用的量可为治疗有效量。所述治疗有效量可指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍；(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状；或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的所述药物的用量。治疗有效量可以通过在已知的体外或体内(例如动物模型)系统中测试而确定。

105、进一步地，所述施用包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、透皮注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、腹膜内注射、鞘内注射、微针注射、瘤内注射、粘膜给药、口服、口鼻腔喷入、雾化吸入、体内植入和体外携带装置给药。

106、优选的施用方式(给药途径)是胃肠外(如静脉内、肌肉内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内)给药。技术人员应理解，给药途径将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的纳米抗体、双特异性抗体或多特异性抗体、分离的核酸分子、重组载体、重组宿主细胞、抗体偶联物或药物组合物可通过注射或连续输注(包括但不限于静脉内、腹膜内、皮内、皮下、肌肉内、眼内和门静脉内)进行施用。

107、在一些实施方式中，本发明提供的预防或治疗方法还可与其他疗法联合应用，例如采用第二治疗剂进行治疗，所述第二治疗剂可以是抗肿瘤药物、抗炎药物、免疫抑制剂或其他具有治疗活性的药物，包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、盐酸埃克替尼、奥希替尼、阿法替尼、达克替尼、盐酸安罗替尼、贝伐珠单抗、伊马替尼、埃克替尼、索拉菲尼、英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、依那西普、非格司亭、培非格司亭、表柔比星、卡培他滨、顺铂、卡铂、吉西他滨、培美曲塞、紫杉醇、奥沙利铂和氟尿嘧啶。

108、本发明所述纳米抗体、生物材料、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体偶联物或药物组合物可与第二治疗剂分开(通过不同途径同时或基本上同时施用)、依次(在不同时间施用，施用途径可以相同也可以不同)或同时(通过相同途径同时或基本上同时施用)施用于所述受试者。

109、本发明还提供了诊断或辅助诊断claudin 18.2靶点相关疾病的方法，所述方法包括：从受试者分离获得样品，然后利用本文中任一所述的纳米抗体、所述双特异性抗体或多特异性抗体、所述抗体偶联物或所述试剂盒检测所述样品中是否存在claudin 18.2蛋白或claudin18.2蛋白的含量，根据检测结果进行claudin 18.2靶点相关疾病的诊断或辅助诊断。

110、进一步地，所述方法还可包括：将所述检测结果中claudin 18.2蛋白的含量与参考值(疾病诊断标准的claudin 18.2蛋白的含量)进行比较的步骤。所述参考值可以是claudin 18.2蛋白在来自已知不具有与claudin 18.2靶点相关疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。比较的结果可指示所述受试者是否患有与claudin 18.2靶点相关的疾病或是否有患有与claudin 18.2靶点相关的疾病的风险，或者指示患者的病情进展和/或治疗后的康复情况。

111、本发明还提供了筛查claudin 18.2靶点相关疾病的方法，所述方法包括：从受试者分离获得样品，然后利用本文中任一所述的纳米抗体、所述双特异性抗体或多特异性抗体、所述抗体偶联物或所述试剂盒检测所述样品中是否存在claudin 18.2蛋白或claudin18.2蛋白的含量，根据检测结果进行claudin 18.2靶点相关疾病的筛查。

112、进一步地，所述方法还可包括：将所述检测结果中claudin 18.2蛋白的含量与参考值(疾病筛查标准的claudin 18.2蛋白的含量)进行比较的步骤。所述参考值可以是claudin 18.2蛋白在来自已知不具有与claudin 18.2靶点相关疾病的受试者(例如健康对照)的样品中的水平(也称作“阴性参考值”)。比较的结果可指示适用于本发明治疗性产品的广泛人群。

113、本文所述claudin 18.2靶点相关疾病可为claudin18.2阳性肿瘤。

114、本文所述claudin18.2阳性肿瘤可为claudin18.2阳性实体肿瘤。

115、进一步地，所述实体肿瘤可为消化系统肿瘤(如胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠腺癌)。

116、本文所述claudin18.2阳性肿瘤可为claudin18.2阳性癌症或claudin18.2阳性的间皮瘤。

117、本文所述癌症可选自胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、支气管癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、胆囊癌、胆管癌和胃食管交界处腺癌。

118、本文所述癌症包括早期癌症、中期癌症、中晚期癌症、晚期癌症、复发性癌症和转移性癌症。

119、本发明的纳米抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明纳米抗体的基因，将该基因插入表达载体内，然后转染宿主细胞，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的纳米抗体。本领域技术人员可根据需要选择本领域常规的宿主细胞、表达载体、将表达载体导入宿主细胞的方法以及抗体的分离纯化方法。

120、本发明所述用途(应用)和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。

121、本文所述产品可包括试剂、试剂盒(如治疗试剂盒或检测试剂盒)、芯片、试纸、检测卡、免疫传感器、制剂、药物和药物组合物等。

122、本文所述样品可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片或细针抽吸组织)等。

123、本文所述受试者可为人类或非人类动物。在某些实施方案中，所述受试者患有claudin18.2靶点相关疾病。

124、本文所述非人类动物可为非人类哺乳动物。

125、本文所述非人类哺乳动物可为小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪，犬，羊，猴，兔、猫、牛、马中的任意一种但不限于此。

126、本发明利用细胞抗原免疫2只羊驼混合构建纳米抗体噬菌体文库，通过噬菌体展示技术和亲和筛选从纳米抗体表达文库中获得高亲和力、高特异性的抗claudin 18.2纳米抗体。经测序得到抗体基因序列后，采用基因工程的方法制备纳米抗体(cldn18.2-vhh-319和cldn18.2-vhh-357)。进一步对获得的纳米抗体进行了亲和力、特异性等功能实验。结果表明，本发明的纳米抗体具有高度的亲和力和特异性。其能够特异性结合cldn18.2阳性细胞，而对cldn18.2阴性细胞不结合，尤其是与其结构极其相似(高达92％的同源性)的人cldn18.1抗原无反应，可见其针对cldn18.2膜蛋白空间结构具有高度特异性，作为纳米抗体治疗肿瘤，不仅具有更强的抗肿瘤活性，能够高效靶向杀伤表达cldn18.2的肿瘤细胞，而且可以在靶向诊断治疗的同时避免治疗性抗体与人cldn18.1等蛋白非特异结合而导致的毒、副作用。

127、本发明的纳米抗体可以在原核细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产，可制成临床上用于claudin 18.2靶点相关疾病的预防治疗药物、诊断药物、claudin 18.2蛋白的检测产品或claudin 18.2蛋白的体内显像产品等。作为小分子量的纳米抗体，其免疫原性低、分子量小、组织穿透性强、结构稳定、半衰期短，在体内可以被快速清除，减少副作用，并且易于重组表达、生产成本低，可单独使用或作为载药系统携带相关药物，在药物应用和临床诊断等领域具有十分广阔的前景和重要的意义。

128、术语定义

129、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

130、术语“表达盒”通常是指包含足以表达目的基因的核酸元件的核酸构建体。典型的表达盒包含启动子、mcs(多克隆位点，multiple cloning site)和终止子。表达盒还可以包括目的基因、标记基因(如tk基因、dhfr基因、cat基因和neo基因)核糖体识别和结合位点(sd)、转录因子结合位点(tfbs)、增强子、沉默子、阻遏子、内含子、加poly(a)信号序列和/或mrna剪接信号序列等。表达盒中各元件之间可以直接连接或通过接头间接连接。

131、术语“载体(vector)”通常是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和/或表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得扩增和/或表达。本领域技术人员可以根据基因工程的目的和受体细胞的性质选择合适的载体。所述载体包括但不限于：质粒(plasmid)、噬菌体(phage，如λ噬菌体或m13噬菌体)、黏粒(cosmid，即柯斯质粒)、噬菌粒(phagemid)、穿梭载体(shuttle vector，如酵母表达载体)、ti质粒、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、p1人工染色体(pac)或ti质粒人工染色体(tac))、病毒载体(如杆状病毒载体、逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒))。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

132、术语“微生物”通常包括细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体、藻等。例如所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)(如大肠杆菌)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)(如根癌农杆菌)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)、产碱菌属(alcaligenes sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)和芽胞杆菌属(bacillus sp.)(如芽孢杆菌)等。所述病毒可包括轮状病毒、杆状病毒、逆转录病毒(如慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、乳头瘤病毒、流感病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)和疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等。所述真菌可来自酵母菌属(saccharomycessp.)(如酿酒酵母、甲醇酵母、毕赤酵母)、镰刀菌属(fusarium sp.)、丝核菌属(rhizoctonia sp.)、轮枝菌属(verticillium sp.)、青霉属(penicillium sp.)、曲霉属(aspergillus sp.)和头孢霉(cephalosporium sp.)等。所述放线菌可来自链霉菌属(streptomyces sp.)(如链霉菌)。所述藻可来自蓝藻门(cyanophyta)(如蓝藻)、墨角藻属(fucus sp.)、曲壳藻属(achnanthes sp.)、茧形藻属(amphiprora sp.)、双眉藻属(amphora sp.)、纤维藻属(ankistrodesmus sp.)、星胞藻属(asteromonas sp.)和黄金色藻属(boekelovia sp.)等。

133、术语“宿主细胞”也称为受体细胞，通常是指可用于导入载体的任何类型的细胞，例如植物细胞和动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，其中：所述植物细胞可为拟南芥(arabidopsis thaliana)、烟草(nicotiana tabacum)、玉米(zea mays)、水稻(oryza sativa)、小麦(triticum aestivum)等植物细胞但不限于此；所述动物细胞可为哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、中国仓鼠卵巢细胞亚株(cho-k1细胞)、非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、sv40转化的非洲绿猴肾细胞(cos细胞)、幼仓鼠肾细胞(bhk细胞)、小鼠乳腺癌细胞(c127细胞)、人胚胎肾细胞(hek293细胞)、人hela细胞、成纤维细胞、骨髓细胞系、t细胞或nk细胞等)、禽类细胞(例如鸡或鸭细胞)、两栖类细胞(例如非洲爪蟾(xenopus laevis)细胞或大鲵(andrias davidianus)细胞)、鱼类细胞(例如草鱼、鲤鱼、虹鳟鱼或鲶鱼细胞)、昆虫细胞(例如sf21细胞、sf-9细胞或hi-5)等但不限于此。

134、术语“重组载体”通常是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体dna分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。

135、术语“重组微生物”通常是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物。如将外源目的基因或重组载体导入目的微生物，或直接对目的微生物的内源基因进行基因编辑。

136、术语“重组宿主细胞”通常是指对宿主细胞的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组宿主细胞。如将外源目的基因或重组载体导入宿主细胞，或直接对宿主细胞的内源基因进行基因编辑。

137、术语“连接”通常是指两个或更多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。本文中所述连接可通过肽键(peptide bond)直接连接，或通过连接子(接头)连接。

138、术语“接头(linker)”也可称为连接肽、肽接头或连接子，用于融合、偶联、连接(link)或接合(join)两个蛋白质或多肽，可防止空间位阻。linker为两个融合蛋白间起连接作用的氨基酸链，具有一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能。应当理解，接头的存在是任选的，柔性接头的长度也是可以调节的，以允许融合蛋白的正确折叠或实现最佳生物活性。接头的特征及其对特定目的的适用性在本领域是已知的，本领域技术人员可以独立地选择和优化每个肽接头。

139、术语“信号肽”通常是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度一般为5-30个氨基酸)。本发明所述纳米抗体可进一步包含信号肽，从而有助于其在宿主细胞中的分泌表达。

140、术语“同一性”通常是指两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。本文所述同一性可指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员知晓，可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。此外可以使用序列分析软件(如clc main workbench和megaligntm)进行测定，例如使用缺省参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。本文所述75％以上同一性可为至少75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。本文所述80％以上同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上的同一性。

141、术语"保守置换"通常是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如met、ala、val、leu和ile)、中性亲水侧链残基间(例如cys、ser，thr、asn和gln)、酸性侧链残基间(例如asp、glu)、碱性侧链氨基酸间(例如his、lys和arg)或芳香侧链残基间(例如trp、tyr和phe)进行保守置换。本领域己知保守置换通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。

142、术语“抗体”通常是指能够特异性结合靶抗原的免疫球蛋白，包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体(包括嵌合抗体、cdr移植抗体和sdr移植抗体)以及全人抗体。当提及术语“抗体”时，除非上下文明确指出，其不仅包括完整抗体，而且包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段。并且抗体可以是不同类型的抗体，例如，igg、iga、igd、ige、igm及其亚型。

143、术语“纳米抗体(nanobody)”也称为单域抗体(sdab)，通常是指只由一个h链v区组成的抗体，也可称为vhh抗体。纳米抗体与抗原结合的能力极其稳定性，与完全抗体基本一致。在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。抗原结合片段是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在n端或c端处截短以使其仅包含部分fr1和/或fr4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

144、术语“双特异性抗体(bsab)”通常是指可同时结合到具有不同结构的两个靶标的抗体，例如，两个不同的靶抗原、同一靶抗原上的两个不同表位。本领域已知多种不同的双特异性抗体结构，例如有fc部分的igg-like双特异性抗体和无fc部分的non-igg-like双特异性抗体。其中无fc部分的non-igg-like双特异性抗体包括仅由两个纳米抗体组成的结构，称为双特异性纳米抗体(bsnb)。

145、术语“多特异性抗体”在本文中是指可以与同一抗原的多个(两个以上)不同抗原表位或者多个(两个以上)不同抗原相结合的一种抗体分子。

146、术语“fab”即“fab抗体”，通常是由重链fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。将重链fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达fab抗体，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链fd指fab中约1/2的h链部分(包括vh、ch1和部分铰链区)。

147、术语“fab′”即“fab′抗体”、“fab′片段”，通常是指含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条重链的部分。

148、术语“f(ab′)2”即“f(ab′)2抗体”、“f(ab′)2片段”，通常是指含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab′片段组成。

149、术语“fv”即“fv抗体”，通常是指可分别构建含有vh和vl基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性fv抗体；也可在载体中的vh和vl之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成fv抗体。

150、术语“单链抗体(scfv)”通常是指用适当的寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(scfv)。多肽链能自发折叠成天然构想，保持fv的特异性和亲和力。

151、术语“最小识别单位(mru)”通常是指仅含可变区中单一cdr结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。

152、术语“互补决定区”或“cdr”通常是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。cdr可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统、chothia编号系统或imgt编号系统中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员很容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。

153、术语“框架区(framework region，fr)”通常是指抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。

154、术语“表位”通常是指抗原上被抗体的互补位结合的任何抗原决定簇。包括线性表位和构象表位。表位可以通过本领域熟知的任何方法确定，例如常规免疫测定法、抗体竞争性结合测定法或x射线晶体学或相关结构测定方法(例如核磁共振光谱)。

155、术语“抗体偶联物”在本文中不仅包括抗体(包括纳米抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等)通过连接子与药物(预防、治疗、诊断疾病的物质)偶联形成的抗体药物偶联物(adc)，还包括抗体(包括纳米抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等)与可检测的标记偶联得到的偶联物。

156、术语“免疫传感器”通常是指把抗原或抗体固定在固相支持物表面，将特异性免疫反应与高灵敏度的传感技术结合起来，监测抗原-抗体反应，从而来检测样品中的抗原或抗体。免疫传感器能达到定量检测的效果，且可实现实时监控，是一种定量化、自动化的免疫检测和诊断产品。

157、术语“导入”通常是指将外源基因转入受体细胞如真核受体细胞或原核受体细胞中。导入的方法没有特别限制，任何已知的转化方法只要能将目的基因(如本发明纳米抗体的编码基因)转入受体细胞中即可。所述导入的方法可包括以下任一种：(1)通过化学转化法(如ca离子诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法等)或物理转化法(如电穿孔转化法)将目的基因或含有目的基因的重组载体导入宿主菌。(2)通过噬菌体转导的方法将目的基因转导进入宿主菌。(3)通过物理或化学方法将目的基因直接转入植物受体细胞，如化学刺激法、电击法、脂质体介导法、显微注射法、基因枪法、激光微束法、花粉管通道法、超声波法、气枪法和涡流法等。(4)以载体为媒介将目的基因转入植物受体细胞，如农杆菌ti质粒载体(包括ti质粒衍生的载体如共整合载体系统和双元载体系统)介导法。(5)通过磷酸钙共沉淀法、阳离子聚合物法、脂质体介导法、电穿孔法、显微注射、基因枪法或病毒载体法等将目的基因导入离体动物细胞(转染)。

158、术语“claudin18.2阳性肿瘤”通常是指表达claudin18.2蛋白的肿瘤。检测肿瘤claudin18.2蛋白表达的方法是本领域技术人员熟知的，例如可以通过基于抗原抗体特异性反应的免疫学检测法(如免疫组织化学法、facs等)测定claudin18.2蛋白的表达，也可以通过实时荧光定量pcr、northern blotting或rna原位杂交的方法来测定claudin18.2mrna的表达。

159、术语“预防”通常是指为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。

160、术语“治疗”通常是指为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病范围的缩小、疾病的稳定(即不再恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，无论是可检测还是不可检测的。此外，治疗还可以指与受试者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。

161、术语“诊断”通常是指可以确定受试者是否可能患有给定疾病或病症的方法，其包括但不限于以抗原或病原体为特征的疾病或病症。技术人员通常基于一种或多种诊断指标进行诊断，其存在、不存在、量或量的变化指示疾病或病症的存在、严重性或不存在。其他诊断指标可以包括患者病史；身体症状等。术语“诊断”还包括预测和/或监测疾病或病症的过程，包括监测一个或多个患者对施用药物或候选药物的反应，例如以确定其疗效。

162、术语“参考值”通常是指可以预先从受试者、从另一受试者(包括健康受试者和患者)获得的参考水平，可以根据本领域技术人员已知的技术测量和选择适当的参考水平。