一种猪流行性腹泻病毒自复制mRNA疫苗的构建方法与应用

本发明涉及生物医药，特别是涉及一种用于猪流行性腹泻病毒的自复制mrna疫苗的构建方法和应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，pedv)感染引起的一种高度接触性消化道传染病，不同年龄、不同品系的家猪都可感染，该病毒对哺乳仔猪的危害最大，可引起两周龄以内仔猪的严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率，死亡率可高80-100％。感染pedv组织病理学变化主要呈现为小肠绒毛萎缩、坏死，是当前严重危害养猪业的重要疫病。1971年，pedv首次于英国被报道。1977年，pedv经典毒株cv777在比利时被分离到。由于严格的饲养环境和有效的疫苗保护，pedv在欧洲和亚洲国家仅呈现零星散发状。然而2010年，高致病性pedv变异毒株在我国爆发，感染仔猪的死亡率可高达100％。至2013年，高致病性pedv变异毒株在美国、加拿大、墨西哥和东南亚等国家或地区呈大规模流行。虽然用商业化的灭火疫苗或弱毒疫苗进行免疫，但由于灭活疫苗或弱毒疫苗对pedv变异毒株的交叉保护效果较差，加上变异毒株的不断演化，pedv感染在猪群中仍时有发生，因此设计更有效的疫苗用于pedv的防治迫在眉睫。

2、mrna疫苗是将编码抗原蛋白的mrna导入体内，在体内表达出抗原蛋白，诱导机体产生特异性免疫应答，从而使机体获得免疫保护。相比传统疫苗，mrna疫苗能同时诱导细胞免疫与体液免疫，并且具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、生产效率高、易规模化扩大等特点。自复制mrna疫苗相比于普通的mrna疫苗有着一些明显的优点。首先，自复制mrna疫苗具有更高的表达效率，可以在细胞内快速翻译成大量的病毒抗原蛋白，从而激发更为强大和持久的免疫反应。其次，自复制mrna疫苗具有更长的保护期，因为它可以不断自我复制并产生更多的抗原蛋白，从而延长免疫记忆的持续时间。总的来说，自复制mrna疫苗具有更好的疗效和更安全的特点，将有望成为未来疫苗研发领域的重要突破口。

3、虽然针对pedv的传统的mrna疫苗已有报道，像cn113274491a，但传统的mrna疫苗仍然存在着一些问题，例如mrna在体内容易降解导致抗原蛋白的表达量低，在体内不能持久的刺激免疫系统等。和传统的mrna疫苗相比，自复制的mrna疫苗(self-amplifyingmrnavaccines)可以自我复制，从而显著增加抗原蛋白的表达量。该发明的自复制mrna利用委内瑞拉马脑炎(vee)病毒rna复制子，可以在宿主细胞内对抗原mrna进行复制，从而大幅增加抗原的生产。相比之下，传统的mrna疫苗只能通过直接翻译mrna序列产生抗原，表达量有限。由于自复制mrna可以在体内复制并增强抗原表达，因此所需的初始剂量要低得多。这不仅可以降低生产成本，还能减少因疫苗剂量过高可能引起的副作用风险。较高的抗原表达水平可以导致更强的免疫反应。自复制mrna疫苗的高效表达可以更持久地刺激免疫系统，从而产生更长时间的保护效果。这对于需要强大和持久免疫反应的传染病疫苗特别重要。自复制mrna疫苗可以减少生产和分装过程中所需的原材料和体积，因为单剂量疫苗所需mrna的量明显减少。因此自复制的mrna疫苗在提高抗原表达、降低剂量需求、增强免疫反应、提高生产效率等方面表现出显著优势，这些特性使其在传染病防治中具有很大的潜力

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明针对pedv的刺突蛋白s，对其进行核苷酸序列进行设计和优化，并克隆到自复制载体中得到性能更为优异的自复制pedv mrna疫苗。

2、首先，本发明提供一种广谱抗猪流行性腹泻病毒的抗原片段，所述抗原片段中首先进行了密码子的优化，同时去除原始序列中的重复区域，以避免mrna中的茎环结构，并促进合成过程。修饰不需要的序列，包括分子克隆中使用的限制性酶切位点和负顺式作用位点，整个序列被微调以增加翻译效率和延长mrna的半衰期。显著地增强了抗原蛋白的免疫原性，增加了施用对象体内产生的针对pedv的中和抗体，所述抗原片段的氨基酸序列为：seq id no.2所示。

3、本发明的一个方面提供一种重组核酸，其特征在于，包含编码所述优化后的pedvs基因的核酸，优化后序列为seq id no：1所示。

4、本发明的一个方面提供一种重组mrna，其特征在于，包含编码所述优化后的pedvs蛋白的mrna。

5、进一步地，所述的重组mrna，其特征在于，所述mrna还包含5ˋ-utr，3ˋ-utr，polya序列，ires序列中的一种或多种。

6、进一步的，所述5ˋ-utr的核苷酸序列为：

7、gaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatgccgccttaaaattttta ttttattttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaatatttc，polya序列为aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

8、本发明的一个方面提供一种表达盒，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna。

9、本发明的一个方面提供一种载体，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒；优选地，所述载体包含自复制载体；更优选地，所述自复制载体包含vee自复制载体；最优选地，所述载体为t7-vee载体。

10、本发明的一个方面提供一种细胞，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体。

11、本发明的一个方面提供一种重组菌，其特征在于，包含所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体；优选地，所述菌为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)、e.coli origami b(de3)或e.coli rosettablue(de3)中的一种；最优选地，所述大肠杆菌为e.coli bl21(de3)。

12、本发明的一个方面提供一种组合物，其特征在于，包含所述优化后的pedv s蛋白、或所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体、或所述细胞、或重组菌。

13、本发明的一个方面提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述优化后的pedv s蛋白、或所述重组核酸、或所述重组mrna、或所述表达盒、或所述载体、或所述细胞、或所述重组菌、或所述组合物。

14、本发明的一个方面提供一种猪流行性腹泻病毒自复制mrna疫苗，包含：

15、(a)所述重组mrna；和

16、(b)药学上可接受的载体；优选地，所述载体包含脂类；更优选地，所述脂类包括阳离子脂质、可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、dmg-peg2000中的一种或多种。

17、本发明的一个方面提供一种表达猪流行性腹泻病毒自复制mrna重组表达载体、非加帽mrna重组表达载体或自复制rna重组表达载体的制备方法。

18、本发明的一个方面提供所述优化后的pedv s蛋白、或所述重组mrna在以下任一项中的用途：(i)制备治疗或预防pedv感染引起的疾病的药物；或者，(ii)制备治疗或预防pedv的药物；或者(iii)制备在施用对象体内诱导产生针对pedv的特异性免疫反应的药物。

19、进一步的，所述猪流行性腹泻病毒(pedv)自复制mrna疫苗适用于多种pedv毒株，所述pedv毒株包括经典毒株1型(1a和/或1b)和/或变异毒株2型(2a和2b)。

20、有益效果

21、本发明提供了一种基于猪流行性腹泻病毒s蛋白基因的自复制mrna。选取pedv的s蛋白作为抗原，设计并构建了相应的自复制mrna疫苗。研究以genbank数据库中g1b型pedvsd毒株的s基因序列(genbank:mz596343)为参考，我们首先优化了s蛋白基因的序列，优化后的s蛋白基因在细胞上的表达量明显优于未优化的s蛋白基因序列。然后将s蛋白基因编码序列插入到改良的t7-vee-mrna载体中，形成了重组载体质粒t7-vee-mrna-s。优化后的蛋白的免疫原性显著增强，增加了体内产生的针对pedv的的中和抗体。因此可以用较少的疫苗剂量达到保护效果。因此减少接种剂量相应的也减少了脂质体使用量，进而减少脂质体所产生的细胞毒性，在保证免疫效果的同时降低了疫苗的毒性。

22、随后，对该重组载体质粒进行酶切线性化处理，通过t7转录酶在体外转录获得可自复制的mrna。最后，利用纳米脂质颗粒(lnp)进行包装，成功制备了具备自复制能力的猪流行性腹泻mrna疫苗。疫苗有效性试验表明，本发明的自复制pedv mrna疫苗具有良好的免疫原性。本发明通过免疫balb/c小鼠动物试验评价了自复制pedvmrna疫苗的免疫效力，结果表明，最低以3μg的自复制mrna疫苗剂量免疫两次(间隔2周)，即可诱导小鼠体内产生高水平的针对g1b型pedv的中和抗体。实验证明本发明基于mrna的疫苗在小鼠实验中有很强的免疫反应，且mrna自身具有佐剂效应，因此能够诱导产生显著的免疫应答。