基于EXPAR-CRISPR/Cas12a检测微生物的试剂盒及其检测方法

本发明属于食品和疾病的生物检测领域，具体涉及基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

1、在食源性人畜共患疾病中，沙门氏菌是引起食源性疾病的主要病原菌之一。肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis, s. enteritidis)是沙门氏菌属中主要的血清型，具有广泛的宿主谱。适配体是利用指数富集的配体进化技术（systematic evolution ofligands by exponential enrichment，selex）从特定的寡核苷酸库中筛选出能与靶分子特异性结合的寡核苷酸。适配体能直接捕获样品中的肠炎沙门氏菌，若在适配体上修饰功能性短单链形成探针，在识别目标菌后，功能性短单链被释放，可完成核酸分子信号的转化。指数等温扩增技术（exponential isothermal amplification reaction，expar）可以迅速放大核酸检测信号，在检测过程中可以缩短检测时间，提高检测灵敏度。由聚集的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr）和crispr相关蛋白（crispr associated proteins，cas）组成的crispr/cas12a体系可以在序列特异性rna分子的引导下识别和降解外源核酸，在特异性识别其靶dna后被激活后，非特异性地切割附近的报告探针，一个被激活的cas12a可以诱导数千个非特异性报告探针降解，在紫外灯照射下发出荧光，达到可视化效果。因此，crispr/cas12a技术一旦结合了适当的信号读出策略，就可以用肉眼或简单的设备轻松观察放大后的信号，满足了现场即时检测的需求。本研究系统地从crispr技术与expar技术的反应条件方面探究了两个体系的兼容性，开发出expar-crispr/cas12a融合体系。此外，基于该检测方法，本研究设计并开发检测肠炎沙门氏菌的小型现场装置，能借助智能手机快速读取荧光结果，更好地满足偏远复杂地区的检测需求。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，而提供基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒及其检测方法。

2、基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒，它包括：信号转化体系、expar-crispr融合体系；

3、所述的信号转化体系包括：探针、适配体、模板链、0.9×rcutsmart缓冲液和去核酸酶水；

4、所述的expar-crispr融合体系，包括：0.8-1.2×ne缓冲液、600-700 μm dntp、1.6-2.4 u/μl nt.bbvci、0.5-1.3 u/μl klenow fragment (3'-5' exo- ) polymerase、100-110 mm tris-hcl、1.5-2.5 μm rnp、5-15 μm报告探针和去核酸酶水；

5、所述的rnp为：将5 μl 10×ne2.1、0.5 μl 2.0 μm engen®lba cas12a和1.5 μl3 μm grna、43 μl去核酸酶水混合，37℃共孵育30分钟，制得；

6、所述的expar-crispr融合体系，包括：1×ne缓冲液、652 μm dntp、2.0 u/μlnt.bbvci、1.0 u/μl klenow fragment (3'-5' exo- ) polymerase、108 mm tris-hcl、2.0 μm rnp、11 μm报告探针；

7、所述的信号转化体系为170-200 nm探针、170-200 nm适配体、0.46 μm模板链、0.9×rcutsmart缓冲液；探针浓度与适配体浓度之比为1：1；。

8、所述的信号转化体系为3.5μl、expar-crispr融合体系11.5μl；

9、所述的报告探针为：/6-fam/ttattatt/iabk/；

10、所述的微生物为肠炎沙门氏菌；

11、所述的探针为：

12、ccctggcttctggac；

13、所述的适配体为：

14、tcggcaacaaggtcacccggagaagatcggtggtcaaactgcataggtagtccagaagccaggg

15、所述的模板链为：

16、gtccagaagccgctgagggtccagaagccgctg-p。

17、食品中检测微生物的方法，采用所述的试剂盒，1）将食品的dna样品10μl和信号转化体系3.5μl混合，室温下放置30分钟；2）加入expar-crispr/cas12a融合体系11.5 μl，39°c加热30分钟，同时打开led灯照射试管，智能手机拍摄记录检测结果。

18、本发明提供了基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域，它包括：信号转化体系、expar-crispr融合体系；所述的expar-crispr融合体系，包括：0.8-1.2×ne缓冲液、600-700 μm dntp、1.6-2.4 u/μl nt.bbvci、0.5-1.3 u/μl klenow fragment (3'-5' exo- ) polymerase、100-110 mm tris-hcl、1.5-2.5 μm rnp、5-15 μm报告探针和去核酸酶水；

19、建立了一种信号转化探针结合expar-crispr/cas12a融合体系的快速、稳定、灵敏的检测微生物的方法，开发出一套现场快速检测装置，实现了对微生物，特别是肠炎沙门氏菌的现场分析。信号转化探针可在无需提取遗传物质的情况下，将肠炎沙门氏菌的菌信号转化成核酸分子信号，避免了在样本处理过程中产生dna污染，并大大减少了检测时间。

20、expar-crispr/cas12a融合体系将核酸分子信号进行快速放大和转化，避免了expar扩增结果的假阳性并简化了操作步骤，为检测结果具有响应速度快、灵敏度高、可视性和检出限低等优点提供了保障。

21、本检测方法的lod为36.3 cfu/ml，低于我国《食品安全国家标准：食品中致病菌限量》（标准编号：gb29921-2013）中规定的检测要求（1000cfu/ml），特异性较好；材料制备工艺简单，成本低廉，检测过程操作简单，检测时间少于1小时；利用该方法检测白菜和鸡肉样品并与金标准方法平板菌落计数法相对比，验证了该方法具有准确性和实用性。

技术特征：

1.expar-crispr融合体系，包括：0.8-1.2×ne缓冲液、600-700 μm dntp、1.6-2.4 u/μl nt.bbvci、0.5-1.3 u/μl klenow fragment (3'-5' exo- ) polymerase、100-110 mmtris-hcl、1.5-2.5 μm rnp、5-15 μm报告探针和去核酸酶水；

2.expar-crispr融合体系，，其特征在于：所述的expar-crispr融合体系，包括：1×ne缓冲液、652 μm dntp、2.0 u/μl nt.bbvci、1.0 u/μl klenow fragment (3'-5' exo- )polymerase、108 mm tris-hcl、2.0 μm rnp、11 μm报告探针。

3.基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒，它包括：信号转化体系、权利要求1所述的expar-crispr融合体系；

4.根据权利要求3所述的基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒，其特征在于：所述的信号转化体系为170-200 nm探针、170-200 nm适配体、0.46 μm模板链、0.9×rcutsmart缓冲液；探针浓度与适配体浓度之比为1：1。

5.根据权利要求4所述的基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒，其特征在于：所述的信号转化体系为3.5μl、expar-crispr融合体系11.5μl。

6.根据权利要求3、4或5所述的基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒，其特征在于：

7.根据权利要求6所述的基于expar-crispr/cas12a检测微生物的试剂盒，其特征在于：所述的微生物为肠炎沙门氏菌；

8.食品中检测微生物的方法，其特征在于：采用权利要求3或6所述的试剂盒，1）将食品的dna样品10μl和信号转化体系3.5μl混合，室温下放置30分钟；2）加入expar-crispr/cas12a融合体系11.5 μl，39°c加热30分钟，同时打开led灯照射试管，智能手机拍摄记录检测结果。

技术总结本发明公开了基于EXPAR‑CRISPR/Cas12a检测微生物的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学技术领域，建立了一种信号转化探针结合EXPAR‑CRISPR/Cas12a融合体系信号转化探针可在无需提取遗传物质的情况下，将肠炎沙门氏菌的菌信号转化成核酸分子信号，避免了在样本处理过程中产生DNA污染，并大大减少了检测时间。EXPAR‑CRISPR/Cas12a融合体系将核酸分子信号进行快速放大和转化，避免了EXPAR扩增结果的假阳性并简化了操作步骤，为检测结果具有响应速度快、灵敏度高、可视性和检出限低等优点提供了保障。LOD为36.3 CFU/mL，检测时间少于1小时。技术研发人员：庞博,范贝贝,李娟,魏佳受保护的技术使用者：吉林大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2