基于单管整合RPA-CRISPR/Cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法

本发明涉及分子检测，具体涉及一种基于单管整合rpa-crispr/cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法。

背景技术：

1、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia,s.maltophilia,sma)是一种革兰氏阴性条件致病菌，该菌除在医院环境中是常见的致病菌，也广泛存在于食物、水、土壤、动植物等自然界中。微生物污染造成的食物中毒占食源性疾病50％以上，食品安全直接关乎人体健康，甚至生命安全。食用被sma致病菌污染的食物容易危及免疫功能低下人群的生命安全，可引起发热、呼吸困难等症状，严重时甚至会危及生命。因此，对嗜麦芽窄食单胞菌进行有效监测对于保障人类健康具有重要的意义。

2、当前sma的检测方法主要有生化培养法、选择性培养基和聚合酶链式反应技术。其中,生化培养法鉴定sma耗时久，延误诊断时间；选择性培养基方法需要在严格无菌的环境中操作，同时也存在培养周期较长、灵敏度低的缺点。pcr技术现已运用到sma的检测中，但由于其依然依赖pcr仪等复杂设备，因而难以实现对sma的即时检测。因此，需要研究一种操作简便、可靠性强的sma检测方法。

3、重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术是由重组酶与聚合酶催化,在37～42℃的恒温条件下对靶标dna特异片段进行扩增,因具有快速、等温、简便而成为现场诊断的首选扩增技术。然而，rpa的非特异扩增会导致假阳性等问题。此外,基于crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-cas(crisprassociated)系统的cas12a而开发的体外诊断技术被证实能够有效的检测病原微生物,具有良好的特异性和可靠性，其最适温度与rpa反应温度相近(均为37℃)，因而可将二者联用。利用rpa技术对样本核酸靶序列进行恒温扩增，使其达到crispr/cas12a体系检测所需的最低浓度，有助于提升其检测的灵敏度。rpa-crispr/cas12a技术展示出了检测特异性强、灵敏度高、适用范围广和操作简单等诸多优点，尤其在病原微生物检测方面展示出较大的应用前景(王文涛,赵良,侯立功,等.rpa-crispr/cas12a在病原微生物检测中的研究进展[j/ol].微生物学通报,1-12[2024-03-31].)。因此，基于rpa扩增结合crispr/cas12a技术用于sma的核酸检测。

4、传统的rpa-crispr/cas12a检测技术体系为两步检测模式，一般遵循先扩增后检测，在扩增产物的转移过程中会存在气溶胶污染的风险。rpa-crispr/cas12a一步检测方法提前将crispr试剂、靶标dna和rpa试剂加入一管进行检测,可以减少二次开盖带来的气溶胶污染并且对灵敏度没有影响。但由于crispr/cas12a切割导致扩增模板丢失，检测效率较低。在先前的研究报道表明，甘油添加剂显著提高了一步rpa-crispr/cas12a的检测效率，与无添加甘油相比，其检测灵敏度接近标准的两步法。该方法具有良好的通用性，已被用于检测sars-cov-2和非洲猪瘟病毒(asfv)，具有很高的灵敏度和特异性(lin,mei,et al."glycerol additive boosts 100-fold sensitivity enhancement for one-pot rpa-crispr/cas12a assay."analytical chemistry 94.23(2022):8277-8284.)。目前，将crispr-cas检测技术应用于嗜麦芽窄食单胞菌的的检测上还未见相关报道。

技术实现思路

1、本发明为了能够实现快速、便捷、精准、灵敏地检测sma而提供了一种基于单管整合rpa-crispr/cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法，该方法只需一步法即可实现对sma的快速高效检测，操作简单，并且不依赖于离心机、pcr仪等大型仪器，具体方案如下：本发明首先提供了用于核酸扩增所用的sma特异引物对，该sma特异引物对可用于特异性扩增sma的靶标基因。rpa特异引物组合为：sma-rpa-f1/sma-rpa-f2/sma-rpa-f3/sma-rpa-r1/sma-rpa-r2/sma-rpa-r3,其序列分别如下：

2、sma-rpa-f1:5’-catcggaatctactttttcgtgggggataac-3’；

3、sma-rpa-f2:5’-caagcgttactcggaattactgggcgtaaa-3’；

4、sma-rpa-f3:5’-cctggaccaacactgacactgacgcacgaaagc-3’；

5、sma-rpa-r1:5’-cctttaccccgccaactagctaatccgacat-3’；

6、sma-rpa-r2:5’-gatgttcctcccgatctctacgcatttcac-3’；

7、sma-rpa-r3:5’-ccaaattgcacccaacatccagttcgcatcgtt-3’。

8、优选所述rpa引物为sma-rpa-f2/sma-rpa-r3。

9、本发明还提供了用于核酸检测所用的sma特异性crrna，该sma特异性crrna为sma-crrna1、sma-crrna2、sma-crrna3，其序列分别如下：

10、sam-crrna1:uaauuucuacuaaguguagaagucuguugugaaagcccug ggcu；

11、sam-crrna2:uaauuucuacuaaguguagaacugcuacaccgggaauucc gcua；

12、sam-crrna3:uaauuucuacuaaguguagagggcguggacuaccagggua ucua。

13、优选所述crrna引物为sma-crrna3。

14、优选地，所述组合物还包括荧光报告探针(single strand dna reporter，ssdnareporter)，所述荧光报告探针的序列为：5′(6-fam)-ttatt-3′(bhq1)；

15、所述荧光报告探针的5’端用6-羧基荧光素(6-carboxyflu orescein，6-fam)修饰，3’端用黑洞淬灭剂1(blackhole quencher-1，bhq1)修饰，是1条短序列单链dna。bhq1和6-fam有光谱重叠，故探针在完整状态下不会释放出荧光信号；当探针被酶切后，不能发生荧光能量共振转移，此时可检测到6-fam释放出的荧光信号。

16、优选地，该检测方法还包括rpa扩增试剂，所述rpa扩增试剂包含：rpa酶、mgoac。

17、优选地，该检测方法还包括crispr/cas12a检测试剂，所述crispr/cas12a检测试剂包含：lbcas12a蛋白、rnase inhibitor、nebuffer4。

18、本发明的再一目的是提供一种基于rpa-crispr/cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法，利用上述任一项所述的检测，包括如下步骤：

19、s1.提取待测样本的dna；

20、s2.rpa扩增：配制rpa反应体系，通过rpa方法扩增上述提取得到的待测样本的dna，得扩增产物；

21、s3.crispr/cas12a系统反应检测：取上述扩增产物，加入荧光报告探针、lbcas12a蛋白和crrna，进行crispr反应检测，读取检测信号，即得；

22、所述crispr/cas12a系统反应的反应体系包括：2μlnebuffer 4(10×，newengland biolab)、0.2μl lbcas12a(母液浓度为0.005μmol·l–1，east mab)、0.625μlcrrna(母液浓度为20μmol·l–1)、0.25μlrnase inhibitor(母液浓度为40u·μl–1，coolaber)、0.8μl ssdnareporter(母液浓度为100μmol·l–1)、3μlrpa扩增产物、用depc-h2o定容至20μl；crispr/cas12a系统反应条件是：37℃孵育30min。

23、本发明的最后目的是提供一种检测方法：基于单管整合rpa-crispr/cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法，利用上述任一项所述的检测，包括如下步骤：

24、s1.提取待测样本的dna；

25、s2.在1支无菌无酶的pcr管底中，加入10μl组分a即crispr/cas12a检测体系和20wt％甘油，在pcr管壁中加入10μl组分b即rpa扩增体系，以最终组装的20μl一管为反应体系，添加完成后在37℃进行反应30min，反应结束后将pcr管置于便携式蓝光led灯下进行照射，若反应体系显荧光为阳性结果，反之则为阴性结果；

26、优选地，所述组分a即crispr/cas12a检测体系包括2.0μlnebuffer4(10×)、0.2μl0.375μm lbcas12a、0.625μl 0.5μm crrna、0.8μl 4μm ssdnareporter、0.25μlrnaseinhibitor(10u)和6.125μl 20wt％甘油。

27、优选地，所述组分b即rpa扩增的反应体系包含29.5μl primer free rehydrationbuffer、2.4μl 10μm正向和反向引物、酶冻干颗粒1颗、2.5μl 280mm magnesiumacetate、2μl待检测的模板dna；

28、优选地，基于单管整合rpa-crispr/cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法，样本dna粗制过程为：

29、在研钵内加入300μl粗提取缓冲液，再加入20mg疑似感染嗜麦芽窄食单胞菌的食品组织，常温下用研磨棒进行充分研磨后转移到1.5ml离心管中，静置10min，取上清即为嗜麦芽窄食单胞菌dna粗提取反应液；

30、所述dna粗制提取液组分包含0.5mol/lnaoh和6wt％peg200，使用depc-h2o溶解。

31、优选地，基于单管整合rpa-crispr/cas12a技术快速检测嗜麦芽窄食单胞菌的方法，样本dna粗制检测过程为：

32、所得到的样本粗制dna，吸取3μl粗制dna直接作为rpa扩增反应的模板，单管整合rpa-crispr/cas12acrispr/cas12a检测体系组分添加、反应过程以及结果判定参照上述步骤。

33、本发明的有益效果为：

34、(1)本发明避免核酸污染：rpa-crispr/cas12a在前期报道中多采用两步检测模式，在此过程中需要频繁的进行移液操作、开合反应管等步骤，从而使检测程序复杂化，且存在气溶胶污染的风险,极大地影响实验结果。本发明将核酸扩增与核酸检测在一管中反应,方法可以避免了在反应过程中可能存在的核酸污染。

35、(2)本发明操作简便、实时可视、可靠性强。本发明针对sma核酸序列设计并筛选相应的特异扩增rpa引物和crrna,开发了基于rpa-crispr/cas12a一步法的sma检测方法。本方法在实施中操作简单，无需借助特殊的设备以及较长的反应时间，且检测结果可靠。为sma污染食物而引起的疾病的防控提供了可靠、有效的技术保障,在现场即时检测(poct)领域具有广泛的应用前景。

36、(3)本发明反应温度条件为恒温37℃，在一管中完成了核酸扩增与核酸检测，节约了大半的试剂成本。