一种枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法、培养方法和在同时提高植物生长和抗病性中的应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法、培养方法和在同时提高植物生长和抗病性中的应用。

背景技术：

1、每年，农作物都会遭受由细菌、真菌、病毒和线虫病原菌引起的各种植物病害，导致作物产量和品质的下降。对此，化学农药仍是保证作物产量的主要方法，但是化学农药造成的污染、食品安全、病原菌耐药性变异等问题日益严重，使得生物方法中基于植物免疫诱导剂的免疫诱导技术，在植物病害防治中发挥着越来越重要的作用。植物免疫诱导剂可以激活植物的防御机制，降低植物病害的严重程度。

2、病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,pamps)，如细菌的鞭毛蛋白(flg22，氨基酸序列为：qrlstgsrinsakddaaglqia)，是病原菌的一类保守分子，这些保守分子可以被植物识别并触发免疫反应。flg22作为一个典型的pamp，其保守的22个氨基酸序列已被广泛研究，并证明是一种有效的植物免疫激活剂。它在植物病害防治中的应用显示出广谱性、持久性、稳定性和安全性等多重优势。

3、然而，由于植物生长和对病原菌的抗性存在天然的权衡关系。植物抗病性的提高往往以牺牲生长和产量为代价，使用这些植物免疫诱导剂不可避免地会抑制植物的生长。因此，如何在不影响植物正常生长的情况下，有效提升其对病原菌的抗性，成为了当前农业科技领域面临的一个难题。在提高抗病性的同时促进植物生长更是农业生产的理想目标。

4、植物根际促生细菌，一类对环境友好且不具致病性的微生物，因其显著的促进植物生长的特性而受到广泛关注(lugtenberg et al.2009；miao et al.2015)。在这些促生细菌中，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，作为根际微生物群落中常见的革兰氏阳性细菌，已经显示出其作为一种高效的植物根际促生细菌的潜力(hashem et al.2019；blakeet al.2021)。这种细菌通过多种机制促进植物生长，包括固定大气中的氮、溶解土壤中的磷，以及分泌有机酸以增强植物对营养的吸收能力(elkoca et al.2007；saeid etal.2018)。枯草芽孢杆菌的一个菌株okb105，已被证实通过产生精胺来促进植物生长(xieet al.2014)。但是还未有植物根际促生细菌表达病原相关分子模式同时促生和提高植物对病原菌的抗性的报道。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法、培养方法和在同时提高植物生长和抗病性中的应用，解决植物对病原菌的抗性和生长能力无法同时提升的问题。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明的第一个方面，公开了一株枯草芽胞杆菌基因工程菌，通过在枯草芽孢杆菌中导入编码病原相关分子模式的经密码子优化的基因得到。

4、优选地，所述枯草芽孢杆菌为具有促生长活性的枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)。

5、进一步优选地，所述具有促生长活性的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌okb105。

6、优选地，所述病原相关分子模式为flg22。

7、进一步优选地，编码flg22的经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.2所示。

8、本发明的第二个方面，公开了上述枯草芽胞杆菌基因工程菌的构建方法，步骤如下：

9、1)将编码病原相关分子模式的经密码子优化的核苷酸序列克隆到枯草芽孢杆菌分泌表达载体上，得到表达病原相关分子模式基因的重组质粒；

10、2)将步骤1)的表达病原相关分子模式基因的重组质粒转化至枯草芽胞杆菌，得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

11、本发明的第三个方面，公开了上述枯草芽胞杆菌基因工程菌的培养方法，活化枯草芽孢杆菌基因工程菌，在带有卡那霉素抗性的lb培养基上划线，37℃培养12～16h，挑取单菌落于带有卡那霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇培养12～16h，离心去上清，重悬，调节至工作浓度。

12、本发明的第四个方面，公开了上述枯草芽胞杆菌基因工程菌在同时提高植物生长和抗病性的应用。

13、优选地，通过枯草芽孢杆菌基因工程菌菌悬液浸种24h或根灌植株，促进植物生长并提高植物抗病性。

14、优选地，所述抗病性包括对丁香假单胞菌和疫霉菌的抗性。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、本发明提供的一种枯草芽胞杆菌基因工程菌，通过对具有促进植物生长作用的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)进行改造，即，将编码病原相关分子模式经密码子优化的核苷酸序列重组到载体后，转化具有促进植物生长的活性的枯草芽孢杆菌，发现得到的枯草芽胞杆菌基因工程菌同时保留了枯草芽孢杆菌促进植物生长的作用，以及病原相关分子模式诱导植物免疫的作用，因而该工程菌具有同时提高植物的生长和抗病性的作用。通过生长和稳定性实验发现转入病原相关分子模式，不影响枯草芽孢杆菌的菌落形态和生长，表明枯草芽胞杆菌基因工程菌具有很好的稳定性。通过用枯草芽胞杆菌基因工程菌菌悬液浸种或根灌，发现两种施用方式对植物生长的促进作用与枯草芽胞杆菌一致，表明枯草芽胞杆菌基因工程菌保持了枯草芽胞杆菌促进植物生长的作用。通过枯草芽胞杆菌基因工程菌喷施或根灌烟草，发现均显著增强了烟草对丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)dc3000δhopq1-1和寄生疫霉菌(phytophthora paracitica)两种不同病原菌的抗性，证实了改造后的okb105(flg22)有效地增强了植物的抗病性。通过辣椒疫霉(p.capsici)-辣椒和寄生疫霉(p.parasitica)-番茄两种病原-植物互作系统评价枯草芽胞杆菌基因工程菌对作物抗性的影响，进一步证明了枯草芽胞杆菌基因工程菌赋予了能够识别病原相关分子模式的作物对多种病原菌的抗性。因此，该枯草芽胞杆菌基因工程菌为同时促进植物生长和免疫提供了一种有前途的策略。

技术特征：

1.一株枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，通过在枯草芽孢杆菌中导入编码病原相关分子模式的经密码子优化的基因得到。

2.根据权利要求1所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为具有促生长活性的枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)。

3.根据权利要求2所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，所述具有促生长活性的枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌okb105。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，所述病原相关分子模式为flg22。

5.根据权利要求4所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌，其特征在于，编码flg22的经密码子优化的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6.权利要求1～5任意一项所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

7.权利要求1～5任意一项所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌的培养方法，其特征在于，活化枯草芽孢杆菌基因工程菌，在带有卡那霉素抗性的lb培养基上划线，37℃培养12～16h，挑取单菌落于带有卡那霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇培养12～16h，离心去上清，重悬，调节至工作浓度。

8.权利要求1～5任意一项所述的枯草芽胞杆菌基因工程菌在同时提高植物生长和抗病性的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过枯草芽孢杆菌基因工程菌菌悬液浸种24h或根灌植株，促进植物生长并提高植物抗病性。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗病性包括对丁香假单胞菌和疫霉菌的抗性。

技术总结本发明公开了一种枯草芽胞杆菌基因工程菌及其构建方法、培养方法和在同时提高植物生长和抗病性中的应用，属于生物工程技术领域。通过将经密码子优化后的编码病原相关分子模式flg22的基因重组到pBE‑S载体中，转化能够促进生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)OKB105，得到能够分泌flg22的重组枯草芽孢杆菌OKB105(flg22)。实验发现，OKB105(flg22)菌悬液浸种或根灌保持了对植物生长的促进作用，有效增强了植物对不同病原菌的抗病性，赋予了能够识别flg22的作物对多种病原菌的抗性，因而该枯草芽胞杆菌基因工程菌为同时促进植物生长和免疫提供了一种有前途的策略。技术研发人员：张美祥,安玉艳,魏新林,张双喜受保护的技术使用者：陕西师范大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18